AAV基因治疗的应用研究
所谓基因治疗，就是把一个具有治疗作用的基因放到病人的细胞中，借此替换缺失和功能异常的基因，最终达到治疗某种疾病的方法。尽管早在1990年美国就批准了基因治疗的方案，但是基因治疗真正在临床获批却少之又少。不过近期的一则新闻，无疑是为致力于医学转化的我们打了一针强心剂。5月27日，全球制药巨头葛兰素史克公司（GlaxoSmithKline，GSK）的基因疗法Strimvelis被欧盟批准上市。 GSK获批代表着大型药企正式进入基因治疗商业化的市场，是基因治疗走向市场的又一里程碑事件。这一领域从此不再是镜花水月，而是新一轮的抢跑，终将成为一场血雨腥风的竞争。
当然，Strimvelis并不是全球首个获批的基因治疗药物。早在2012年，欧盟已经批准了UniQure公司研发的应用于脂蛋白脂酶缺乏（lipoprotein lipase deficiency）的基因治疗药物，Glybera。Glybera将功能性LPLD基因包裹进AAV（腺相关病毒），注射入患者的骨骼肌。通过一次性的治疗，达到长期的显著降低急性胰腺炎的发病率。
早期的基因治疗由于不可控的免疫风险，让人又爱又恨，AAV作为免疫原性最低，不整合入细胞核基因组，感染效果最好的载体，为基因治疗带来了新的希望（详见6月23日的文章《医疗黑科技：治病不用药，有光就够了》）。Glybera打响了AAV基因治疗的第一枪，同时开启了基因治疗的可能性。4年过去了，AAV在基因治疗领域又取得了哪些引人瞩目的进展呢？
目前在FDA注册在案的腺相关病毒临床实验有超过100例，其中绝大部分集中在临床一期和二期，一例完成临床三期的招募。今天我们给大家介绍一下2016年上半年最新的，比较有影响力的几个案例。
AAV与Crispr/Cas9基因编辑结合
以往的AAV技术主要集中于将外缘基因导入体内，安全稳定地表达。Cas9作为全新的基因编辑技术被普遍认为拥有广泛的临床应用前景，其与AAV的联合应用，使得基因改造更加有靶向性和高效，两者相得益彰。
2016年2月，AAV载体制造之父，宾夕法尼亚州大学基因治疗研究所的James Wilson 教授利用AAV治疗罕见代谢尿素循环系统障碍。该病是由鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC）缺失导致的。当该酶系中一种酶丢失或者缺陷，氨就会积累在血液中，循环至大脑，最终严重损伤大脑。据报道每40000名出生婴儿中就有一名患有OTC的缺失。James Wilson团队用AAV8血清型载体将作为剪切工具的核酸酶Cas9特异性导入肝细胞中。另一个载体将gRNA带到特异性DNA靶位点，从而达到定点突变。此研究有效提高病理模型小鼠的成活率，文章发表在Nature Biotechnology，发表4个月以来已被多次引用。
中国科学家在CRISPR/Cas9 与AAV的联合应用方面也不甘人后。比如，2016年3月，华东师范大学生命科学院院长刘明耀教授和李大力教授首次证明了通过Cas9基因编辑技术修复F9基因突变治疗B型血友病的可行性。刘教授的团队发现了B型血友病FIX基因的新型突变Y371D，同时找到小鼠上对应的氨基酸位点Y381D，并且利用CRISPR/Cas技术构建了C57BL/6品系的小鼠重症B型血友病模型以及蛋白质序列383位移码突变Y383STOP。然后创新性地利用AAV结合CRISPR/Cas技术在Fix基因原位进行修复，对小鼠尾静脉注射腺相关病毒来递送Cas9、sgRNA和修复模版，成功地修复了部分小鼠肝脏细胞，极大的提高了F9Y381D血友病小鼠的凝血能力和断尾实验中的生存率。文章发表在EMBO Molecular Medicine，影响因子高达9.547。
AAV突破血脑屏障
血脑屏障将脑部与外部环境隔绝开来，能够阻止有害化学物质以及细菌入侵我们的大脑，保卫大脑的安全，但同时大约95%的口服和静脉注射药物也被血脑屏障所阻挡。这就导致医生在进行帕金森等神经退行性疾病的治疗过程中，只能选择直接将药物注射到脑部，而这种侵入性方法需要在颅骨上钻孔才可以实现。在一项最新研究中，神经科学家Viviana Gradinaru利用生物工程方法获得了一种能够穿过屏障的无害病毒，即新型重组腺相关病毒AAV-PHP.B，可以将治疗药物送达脑部。这种方法和病毒必将成为突破性的研究工具，并且具有非常大的临床应用空间。
AAV与光遗传
2016年1月份，浙江大学段树民院士和汪浩研究员领导的团队揭示了小鼠对天敌气味诱导的先天性恐惧的神经环路基础。利用光遗传学，动物行为学和病毒逆向追踪等技术在小鼠大脑里发现从LHb（僵核）到LDT（背外侧被盖区）这一通路在天敌气味诱导的先天性恐惧中起到决定性的作用。LDT中的两类不同亚型的抑制性神经元（PV阳性和SOM阳性）对恐惧反应具有完全相反的双向调节功能。这些新发现为恐惧诱发的焦虑症和抑郁症的治疗提供了新的潜在靶点。该成果发表在Nature Neuroscience上，影响因子高达16分。
由以上几个最新的文章我们可以看出，AAV可以说得上是基因治疗领域当前最火热，最安全，临床应用可能最大的载体！十年磨一剑，霜刃未曾试；AAV主宰基因治疗的时代真的来了！
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