全组织细胞色素氧化酶活性染色试剂盒使用说明
全组织细胞色素氧化酶活性染色试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
全组织细胞色素氧化酶活性染色试剂是一种旨在使用细胞色素C催化人工电子供体染料二氨基联苯胺的非酶源性自然氧化，形成棕褐色不溶性产物，来分析全组织样品中细胞色素氧化酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心改良传统NADI方法、成功实验证明的。主要适用于各种动物组织的细胞色素氧化酶活性的定性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。
技术背景
细胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase）是氧化呼吸链的酶部分的总称。其存在于真核生物的细胞线粒体上，主要通过氧化磷酸化为细胞提供能量。二氨基联苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）是人工电子供体染料，通过与金属蛋白，例如含铁蛋白细胞色素C中的物理性结合，产生非酶源性自然氧化，同时提供电子（细胞色素C作为电子受体）于呼吸链的电子传递系统，由此呈现出颜色变化和沉积，形成棕褐色不溶性产物，且不受乙醇影响。在DAB自然氧化的同时，产生活性氧，例如过氧化氢，由过氧化氢酶防止其聚集。在大量氧化型DAB的存在下，通过细胞色素氧化酶的作用，亚铁细胞色素C被氧化成正铁细胞色素C。由此氧化型DAB棕褐色不溶性产物被用于检测组织细胞中细胞色素氧化酶的活性。
产品内容
清理液（Reagent A） 200毫升
染色液A（Reagent B1） 40毫升
染色液B（Reagent B2） 4瓶
反应液（Reagent C） 3毫升
固着液（Reagent D） 30毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存染色液（Reagent B）和反应液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器
培养箱：用于反应孵育
中性树脂：用于切片封片
光学显微镜：用于切片染色后观察分析
实验步骤
染色开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下融化；移取9毫升染色液A（Reagent B1）到1瓶染色液B（Reagent B2）里，混匀，标记为染色工作液，置于冰槽里备用，避免光照（注意：有效期1周）；继续移取2.7毫升染色工作液到新的1.5毫升离心管，加入300微升反应液（Reagent C），混匀后，标记为反应工作液，置于冰槽里，避免光照。然后进行下列操作。
准备1个6孔细胞培养板
放进新鲜切除的动物组织样本（注意：建议组织大小为0.5厘米厚，1厘米长；如果过大，最好刀切处理一下）
将组织压平
小心加入3毫升清理液（Reagent A），清洗组织样本
小心抽去清理液
小心加入3毫升反应工作液，浸没整个组织
放进37℃培养箱，孵育60分钟，避免光照
小心抽去反应工作液
小心加上3毫升清理液（Reagent A），清洗组织样本
小心抽去清理液
重复实验步骤9至10二次
小心加入3毫升固定液（Reagent D），浸没整个组织
在室温下孵育15分钟
小心抽去固定液
小心加入3毫升清理液（Reagent A），清洗组织样本
在室温下孵育15分钟
小心抽去清理液
重复实验步骤15至17二次
后续石蜡切片（6微米厚）或冰冻切片（10微米厚）
在光学显微镜下观察和计数：表达细胞色素氧化酶活性的组织细胞为阳性组织细胞，呈现棕色。
注意事项
本产品为10次操作
操作时，须戴手套
染色液（Reagent B）和反应液（Reagent C）避免反复冻融
染色工作液不宜久存，1周内使用为佳
阴性对照时，GENMEN反应工作液可含有叠氮化钠
每次更换试剂溶液时，保持切片面基本晾干
试剂溶液在切片表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满切片表面
整个操作，在避光状态下进行
染色孵育时间，根据样品和酶活性强弱调整，通常为1至3小时
染色完成后，即刻进行光学显微镜观察
样品染色后保存，避免光照
细胞色素氧化酶活性染色参考图像：
本公司提供系列组织细胞酶活性染色试剂产品
质量标准
本产品经鉴定性能稳定
本产品经鉴定显色清晰
来源：上海一基实业有限公司
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