真菌/酵母细胞活性内质网（ER）分离试剂盒使用说明
主要用途
真菌/酵母细胞活性内质网（ER）分离试剂是一种旨在通过机械或化学处理和差速离心方法，从真菌/酵母细胞中分离出完整的活性内质网细胞器组分的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于各种新鲜培养或冻存的野生型或突变型真菌/酵母菌菌株细胞的活性内质网的制备。其制备物产量高，活性保证，可以被用于细胞色素P450系统外源化合物（xenobiotics）代谢、脂类代谢、内质网膜蛋白和腔内蛋白等研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量高。
技术背景
内质网（endoplasmic reticulum；ER）是真核生物的细胞器组分，构成细胞内小管（tubules）、囊泡（vesicles）和小池（cisternae/sac）相互连接的网络结构，负责蛋白转译、折叠和转运成为细胞膜成分（例如跨膜受体和其它整合膜蛋白等）或分泌型蛋白（例如消化性酶），负责钙离子区隔（sequestration），以及糖原、固醇类和其它大分子的生产和储存等功能。内质网分成三种：粗面内质网（Rough endoplasmic reticulum；RER）、滑面内质网（Smooth endoplasmic reticulum；SER）和肌质网（sarcoplasmic reticulum；SR）。根据细胞代谢的需要，粗面内质网和滑面内质网会互相转换。粗面内质网通过核糖体合成蛋白质并分类；滑面内质网进行固醇、碳水化合物代谢等。内质网的分离是现代细胞生物学研究的常用手段之一：第一，通过机械或化学方法破裂组织细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得内质网；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的内质网。
产品内容
清理液（Reagent A） 250毫升
平衡液（Reagent B） 250毫升
酶解液（Reagent C） 500微升
裂解液（Reagent D） 40毫升
净化液（Reagent E） 10毫升
强化液（Reagent F） 5毫升
分离液（Reagent G） 80毫升
保存液（Reagent H） 10毫升
活性液（Reagent I） 200微升
产品说明书 1份
保存方式
保存酶解液（Reagent C）、净化液（Reagent E）和活性液（Reagent I）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，严格避免污染；有效保证6月
用户自备
50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
6毫升超速离心管：用于超高速离心的容器
4℃台式离心机：用于样品制备
4℃超速离心机：用于分离细胞器成分
DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞
恒温水槽：用于孵育反应物
平式摇荡仪：用于混匀
实验步骤
实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent E）和活性液（Reagent I）冻融，然后移出20微升活性液（Reagent I）和1毫升净化液（Reagent E）到4毫升的裂解液（Reagent D）里，混匀后，置入冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。
准备好50毫升新鲜真菌/酵母菌样品
在分光光度仪上测OD600＝1.0（1 OD＝1 X 107细胞/毫升；总量为5 X 108细胞）
转移到预冷的50毫升锥形离心管
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
小心抽去上清液
加入25毫升清理液（Reagent A），混匀
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
小心抽去上清液
加入5毫升平衡液（Reagent B），混匀
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
小心抽去上清液
加入2毫升平衡液（Reagent B），混匀
加入50微升酶解液（Reagent C），混匀
放进30℃恒温水槽孵育60分钟，期间每隔15分钟轻轻用手摇匀
加入5毫升平衡液（Reagent B），混匀
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
小心抽去上清液
加入5毫升平衡液（Reagent B），混匀
放进30℃恒温水槽孵育30分钟，继续实验步骤21
同时将平衡液（Reagent B）置入冰槽里预冷30分钟（注意：以下步骤在4℃环境下进行）
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
小心抽去上清液
加入5毫升预冷的平衡液（Reagent B），混匀
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g
小心抽去上清液
加入5毫升含有裂解液（Reagent D）、净化液（Reagent E）和活性液（Reagent I）的裂解工作液
涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
选择下列其中一种方法：
方法一：物理处理法
即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器
在冰槽里用匀浆帮匀化细胞（约20至40下）（注意：参见注意事项10）
将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g
小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
放进4℃超速离心机离心15分钟，速度为12000g
小心移出上清液到预冷的6毫升超速离心管——此步骤获得后线粒体组分（post mitochondrial fraction；PMF）
放进4℃超速离心机再次离心60分钟，速度为100000g
小心抽去上清液，保留沉淀颗粒――此步骤获得内质网组分
如果到此终止，即刻加入1毫升保存液（Reagent H），充分混匀沉淀物
转移到1.5毫升离心管
放进－70℃冰箱里保存
或如果继续分离，按照下列选择步骤操作
（选择步骤）加入4毫升分离液（Reagent G），混匀颗粒群
（选择步骤）转移到15毫升锥形离心管
（选择步骤）再加入4毫升分离液（Reagent G）
（选择步骤）置于冰槽里
（选择步骤）放在平式摇荡仪上混匀15分钟，速度为100RPM
（选择步骤）放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为8000g
（选择步骤）移取上清液到2个预冷的6毫升超速离心管，保留离心后沉淀颗粒――此步骤获得粗面内质网组分（沉淀颗粒）
（选择步骤）加入500微升保存液（Reagent H），充分混匀沉淀物
（选择步骤）即刻转移到1.5毫升离心管
（选择步骤）放进超速离心管到4℃超速离心机再次离心60分钟，速度为100000g
（选择步骤）小心抽去上清液，保留沉淀颗粒――此步骤获得滑面内质网组分
（选择步骤）分别加入250微升保存液（Reagent H），充分混匀沉淀物
（选择步骤）即刻合并转移到1.5毫升离心管
（选择步骤）全部放进－70℃冰箱里保存
方法二：化学处理法
在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
加入预冷的500微升强化液（Reagent F）
涡旋震荡5秒，充分混匀
在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项11）
加入预冷的5毫升裂解液（Reagent D），轻轻摇动试管混匀
放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g
小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
放进4℃超速离心机离心20分钟，速度为12000g
小心移出上清液到预冷的6毫升超速离心管——此步骤获得后线粒体组分（post mitochondrial fraction；PMF）
放进4℃超速离心机再次离心60分钟，速度为100000g
小心抽去上清液，保留沉淀颗粒――此步骤获得内质网组分
如果到此终止，即刻加入1毫升保存液（Reagent H），充分混匀沉淀物
转移到1.5毫升离心管
放进－70℃冰箱里保存
或如果继续分离，按照下列选择步骤操作
（选择步骤）加入4毫升分离液（Reagent G），混匀颗粒群
（选择步骤）转移到15毫升锥形离心管
（选择步骤）再加入4毫升分离液（Reagent G）
（选择步骤）置于冰槽里
（选择步骤）放在平式摇荡仪上混匀15分钟，速度为100RPM
（选择步骤）放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为8000g
（选择步骤）移取上清液到2个预冷的6毫升超速离心管，保留离心后沉淀颗粒――此步骤获得粗面内质网组分（沉淀颗粒）
（选择步骤）加入500微升保存液（Reagent H），充分混匀沉淀物
（选择步骤）即刻转移到1.5毫升离心管
（选择步骤）放进超速离心管到4℃超速离心机再次离心60分钟，速度为100000g
（选择步骤）小心抽去上清液，保留沉淀颗粒――此步骤获得滑面内质网组分
（选择步骤）分别加入250微升保存液（Reagent H），充分混匀沉淀物
（选择步骤）即刻合并转移到1.5毫升离心管
（选择步骤）全部放进－70℃冰箱里保存
注意事项
本产品为10次操作（50毫升菌液：1克细胞湿重或5 X 108细胞）
其它实际操作的细胞量与试剂使用量按比例调整：例如10毫升菌液（OD600=1）：试剂用量是标准用量的五分之一
操作时，须戴手套
50毫升（OD600＝1）菌液湿重约1克
细胞生长条件影响线粒体的质量：建议在有氧条件下富含葡萄糖的培养基培养
实验步骤20以下的所有操作均须在4℃或以下状态下进行
建议使用足够的细胞量
建议严格控制操作时间
操作时，避免污染母液，尤其是平衡液（Reagent B）、裂解液（Reagent D）、和保存液（Reagent H）
通常匀化次数为20下（或细胞颗粒群消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同菌株的细胞会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
通常孵育5分钟达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同菌株的细胞会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数
通常5 X 108细胞的内质网含量为500至1000微克蛋白
本产品所获得的内质网纯度和产量最为理想
如果需要获得95％以上纯度的内质网，使用真菌/酵母细胞高质纯化内质网分离试剂盒－10489.3
内质网的标志蛋白是NADPH细胞色素C还原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）；建议使用 组织NADPH细胞色素C还原酶活性比色法定量检测试剂盒－50303.2
本公司提供系列亚细胞结构分析试剂产品
质量标准
本产品经鉴定性能稳定
本产品经鉴定分离的内质网维持正常活性
本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶
