免疫印迹法试验操作步骤
一蛋白质样品获得:细菌诱导表达后,可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞,真核细胞加匀浆缓冲液,机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃,13,000r离心15min。取上清液作为样品。
二电泳:制备电泳凝胶,进行SDS-PAGE。
三转移:(半干式转移)
1、电泳结束后将胶条割至合适大小,用转膜缓冲液平衡,5min×3次。
2、膜处理:预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜,浸入转膜缓冲液中10min。
3、转膜:转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好,滤纸、凝胶、NC膜精确对齐,每一步去除气泡,上压500g重物,将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2,转移1.5hr。转移结束后,断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色,放入膜染色液中50s后,在50%甲醇中多次脱色,至背景清晰,然后用双蒸水洗,风干夹于两层滤纸中保存,留与显色结果作对比。
四免疫反应:
1、用0.01M PBS洗膜,5min ×3次。
2、加入包被液,平稳摇动,室温2hr。
3、弃包被液,用0.01M PBS洗膜,5min×3次。
4、加入一抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释,液体必须覆盖膜的全部),4℃ 放置12hr以上。阴性对照,以1%BSA取代一抗,其余步骤与实验组相同。
5、弃一抗和1%BSA,用0.01M PBS分别洗膜,5min×4次。
6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释),平稳摇动,室温2hr。
7、弃二抗,用0.01M PBS洗膜,5min×4次。
8、加入显色液,避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
推荐
