AFLP技术
实验概要
本实验介绍了AFLP（amplified fragment length polymorphism）技术。AFLP是一种建立在PCR基础上的限制性片断长度多态性分析，是一种重要而有效的分子标记技术。
主要试剂
AFLP试剂盒、测序胶、银染试剂
主要设备
PCR仪、银染设备
实验步骤
1. 总DNA提取(略)
2. DNA酶切
DNA模板（200ng/ul） 1.25ul
Mse I 5U
Sse I 5U
5×RL Buffer 10ul
加水至 50ul
37℃ 1.5小时
3. 加接头
酶切液 10ul
SseI 接头( 5pmol/ul) 1ul
MseI 接头(50pmol/ul) 1ul
10×连接酶Buffer 2ul
T4DNA连接酶(3u/ul) 1ul
水 5ul
4℃过夜
4. DNA样品的预扩增
连接后样品 5ul
MseI 引物（MOO 50ng/ul） 1.5ul
SseI 引物（POO 50ng/ul） 1.5ul
10×PCR缓冲液 5ul
2.5mMdNTP 4ul
Taq酶(5u/ul) 0.5ul
加水至 50ul
混匀、离心 PCR扩增 PCR参数为
94℃ 30’
56℃ 30’ 30个循环
72℃ 60’
预扩增结束后，样品用0.1M的TE稀释20倍，－20℃保存或用于扩增
5. DNA样品扩增
稀释预扩增样品连接后样品 5ul
MseI 引物（MOO 50ng/ul） 0.5ul
SseI 引物（POO 50ng/ul） 0.5ul
10×PCR缓冲液 2ul
2.5mMdNTP 1.6ul
Taq酶(5u/ul) 0.2ul
加水至 20ul
混匀、离心 PCR扩增 PCR参数为
94℃ 30’
65℃ 30’ 12个循环
72℃ 60’ 复性温度每循环降低0.7℃
94℃ 30’
56℃ 30’ 23个循环
72℃ 60’
6. 扩增产物的检测
测序胶及银染操作(略)。
7. 差异片断的纯化、回收、最扩增、最纯化回收的操作(略)。
