不同DNA甲基转移酶DNMT在癌症发病机制中的作用
DNA甲基化是调控基因表达最重要的表观遗传机制之一。DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMT）在基因组DNA甲基化中起着至关重要的作用。在哺乳动物中，DNMT与某些元件一起调控胚胎和成体细胞的动态DNA甲基化模式。而DNMT异常功能通常是判断癌症的标志，包括抑癌基因（tumor suppressor genes，TSG）的整体低甲基化和部分高甲基化，这些异常会加快肿瘤的恶性程度、加重患者病情、并显著加剧癌症治疗难度。由于DNA甲基化是可逆的，目前DNMT被视为药物开发的重要表观遗传靶点。然而DNMT对癌症的作用仍有争议，靶向DNMT的治疗方法仍在探索中。本文主要综述了主要DNMT与癌症的关系以及DNMT在癌症中的调控机制和临床应用，并重点介绍了几种即将出现的靶向DNMT的策略。
关于DNA甲基转移酶（DNMT）
DNA甲基化是指以共价结合方式获得一个甲基（CH3）基团的过程，其是在DNA序列特定碱基的DNMT催化下作为CH3供体的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的化学修饰过程。在此过程中，胞嘧啶（C）是甲基化最常见碱基，且C位点甲基化主要发生在CpG序列上。在哺乳动物中，部分CpG二核苷酸分散在基因组中，而另一些则出现在CpG岛的密集簇中。CpG岛通常是未甲基化的，常位于调控转录起始和抑制的基因启动子区域中。增强子或启动子中CpG位点高甲基化通常导致转录沉默，而基因组中CpG位点低甲基化通常导致基因表达激活（图1），因此甲基化通常通过基因转录来调控基因表达。而DNA甲基化主要依赖于DNMT，DNMT家族中有五个成员：DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L。DNMT1参与细胞增殖过程中序列甲基化的维持，这是维持DNA甲基化模式以及癌细胞中TSG的异常沉默所必需的；DNMT2可以作为RNA甲基转移酶，修饰某些tRNA的反密码子环中的第38个胞嘧啶残基；DNMT3A和DNMT3B的主要作用是de novo甲基化；DNMT3L属于DNMT3家族，缺失甲基转移酶活性，但DNMT3L可以与DNMT3A/B相互作用以促进de novo DNA甲基化。DNMT3A有两种不同的亚型，而DNMT3B具有30多种亚型，其共同特征是都具有催化活性和结构保守的C-末端结构域，负责结合SAM辅因子并靶向胞嘧啶。这就是为什么它们可以催化CH3基团从SAM转移到胞嘧啶的C5位以形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。总之，DNMT1参与序列甲基化的维持，而DNMT3A和DNMT3B的主要作用是de novo甲基化，也可以参与甲基化的维持。
图1：DNMT导致基因沉默并促进肿瘤发生
另外，这三种DNMT经常在几种癌组织和细胞系中过表达。结合DNA甲基化的可逆性，DNMT被认为是药物开发的重要表观遗传靶标。越来越多的研究观察到肿瘤细胞中CpG位点的甲基化变化，这表示可能存在于癌症和许多非恶性疾病中的异常DNA甲基化。且这些变化与DNA甲基化在启动子、增强子、基因体和调控高阶染色质结构位点引起的分化一致。因此，DNA甲基化异常变化可能是癌症形成和肿瘤进展研究的突破。除癌症外，异常的DNA甲基化还与一些神经系统疾病、免疫疾病、动脉粥样硬化和骨质疏松症有关。因此，了解异常DNMT的分子作用将为临床研究和新药开发奠定理论基础。
关于癌症
癌症已成为主要的全球公共卫生问题，一些生物标记物构成了合理化肿瘤疾病复杂性的组织原则，包括维持促癌炎症、增殖信号、逃避生长抑制因子、避免免疫破坏、抵御细胞死亡、实现复制性永生、导致血管生成、诱导侵袭和转移、基因组不稳定、能量代谢重编程等特征。根据世卫组织的统计数据，癌症造成了全球最大的负担，高达2.446亿残疾调整生命年（disability-adjusted life years，DALY），其中男性和女性分别为1.374亿和1.071亿DALY。近年来，癌症的发病率和死亡率均呈上升趋势，并已成为中美两国的主要死亡原因。分析2020年中国的统计数据，中国最常见的癌症主要是肺癌（占17.9%，约82万新发病例）、结肠癌（占12.2%，约56万新发病例）和胃癌（占10.5%，约48万新发病例）。
癌症通常由进行性基因异常驱动的疾病，包括抑癌基因（TSG）突变、促癌基因突变和染色体异常。同时癌症也由表观遗传改变引起，表观遗传变化的可逆性允许通过在一定条件下敲除表观遗传变化来实现对生物学性状的影响。由此可以看出，表观遗传学的快速发展不仅在分子水平上揭示了复杂的遗传现象，而且为战胜疾病尤其是在癌症领域带来了希望。DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA的调控成为表观遗传治疗的候选。其中DNA甲基化异常被证明与多种类型的癌症密切相关，特别是与在肿瘤发展和进展中起重要作用的TSG有关。由于DNA甲基化发生在癌症的早期阶段，这些基因的转录状态可以通过抑制DNMT活性来调节。因此这些基因不仅能提供有价值的生物标志物，而且还可以提供潜在的治疗靶标。如DNA去甲基化剂核苷5-氮杂胞苷和地西他滨已成功用于低剂量治疗白血病和骨髓增生异常综合征（MDS）。总之，靶向特异性DNMT抑制剂在癌症治疗中的应用具有巨大潜力，但其在治疗实体瘤中的作用尚不明确。
不同类型DNMT在癌症中的功能作用
正常细胞促癌作用主要归因于促癌因子引起遗传物质的功能变化。许多研究人员在血液系统恶性肿瘤等各种类型的肿瘤中经常发现异常的甲基化模式，表明癌症发生和发展伴随着DNMT变化。最近一些研究表明，DNMT1表达的巨大差异是其可能作为去甲基化治疗的潜在生物标志物的基础之一。此外DNMT3A在急性髓系白血病（AML）中高比率突变且与不良预后相关。DNMT3B也在肿瘤细胞中过表达，例如在人黑色素瘤中起促癌作用。而DNMT3B缺失则显著抑制BRAF/同源性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）小鼠黑色素瘤模型中的黑色素瘤形成。这些发现表明，不同DNMT在癌症发生中起着至关重要的作用。本文主要总结了DNMT1、DNMT3A和DNMT3B在癌症中的作用，希望能够为癌症的治疗提供新的思路（表1、表2）。
表1：DNMT及其在各种癌症中的表达
表2：癌症中DNMT的下游基因或蛋白
（1）DNMT1与癌症
DNMT1基因位于染色体19p13.2上，具有4851bp的全基因组蛋白编码区，编码约183kDa蛋白。此外，能够维持DNA甲基化模式的DNMT1对半甲基化DNA模板具有高亲和力，充分证据表明DNMT1是实体瘤和血液恶性肿瘤中的癌蛋白。DNMT1在多种癌症中发挥促癌作用，如乳腺癌（BC）、肺癌、结肠癌、骨肉瘤。因此研究人员一直在努力研究DNMT1在癌症中的作用机制，旨在提高综合治疗的有效性。
Belinsky等人使用含有DNMT1基因等位基因的小鼠模型以研究DNMT在癌症形成中的作用。在此过程中发现DNMT1敲低导致烟草促癌物引起的肺癌发生率下降，DNMT活性在诱导肺癌的肺细胞中也受到抑制，表明DNMT1和组蛋白去乙酰化酶活性降低可能会阻断表观遗传学介导的基因沉默，这可能为帮助预防肺癌提供了一种新的临床策略。此外证据表明，人类MutL同源基因1（hMLH1）和人类MutS同源基因2（hMSH2）与癌症发展和耐药性密切相关。在前人研究的基础上，Wu等人2020年发现DNMT1可通过促进其启动子甲基化来抑制hMLH1和hMSH2表达，从而促进表皮生长因子受体（EGFR）突变的非小细胞肺癌（NSCLC）中的细胞增殖。EGFR由于其频繁的过表达和过度活化而成为人类恶性肿瘤的治疗靶点，而微管相关肿瘤抑制因子1（MTUS1）已被鉴定为多种肿瘤中的抑癌基因（TSG）。在Parbin等人的先前研究中，DNMT抑制剂处理导致启动子甲基化降低，同时H3K9Ac富集和MTUS1表达上调，表明DNMT1表达水平在NSCLC细胞系A549中上调，且DNMT1和MTUS1功能之间存在负相关。
DNA甲基化异常在胰腺导管腺癌（PDAC）的促癌过程中发挥重要作用，约80%的癌症DNMT1蛋白过表达，如分析20个胰腺癌（PC）细胞系，发现其中16个细胞系的表达水平比对照组非肿瘤细胞系高约2-5倍。p53是一种重要的TSG，其失活与肿瘤发生高度相关，在此基础上Godfrey JD等人证明大部分PDAC携带TP53的特异性突变，如p53R172H促进转移。该研究显示，与正常对照组相比，PDAC模型中Kras p53R172H组织和Kras p53R172H细胞系的DNMT1表达水平均上调。在本实验中，RAS（rat sarcoma）是癌症中最常见的突变促癌基因，KRAS（Kirsten rat sarcoma）突变是最常见的突变RAS亚型，占人类癌症中观察到的RAS突变的80%以上。除上述研究外，Wong等人验证了DNMT1在抑制PDAC细胞分化，促进其增殖、侵袭和迁移以及通过TSG启动子高甲基化诱导PDAC癌症干细胞的自我更新能力方面发挥促癌作用。
Etoh等人表明DNMT1不能在正常上皮细胞中发现，但在大多数胃癌（GC）中被发现。此外DNMT1在GC组织中过表达与E-cadherin蛋白表达降低密切相关，表明DNMT1表达水平上调将提高癌细胞的迁移能力。lncRNA通过甲基化修饰来调控靶基因，如lncRNA SAMD12-AS1。在功能上，lncRNA SAMD12-AS1可以增强DNMT1与p53结合并加速对p53的降解，从而抑制GC发生和发展。而DNMT1表达水平增加受肿瘤相关巨噬细胞（TAM）调控，DNMT1上调通过肿瘤抑制因子凝溶胶蛋白（Gelsolin）加重GC，而后者介导表观遗传抑制。
先前研究表明，由MHC（major histocompatibility complex）介导的抗原呈递是抗肿瘤免疫和对PD-1/PD-L1靶向治疗反应的重要修饰因子之一。以此结论为背景，Luo等在2018年使用免疫组织化学发现经guadecitabine（DMTi，DNA甲基转移酶抑制剂）治疗后， CD8 T细胞浸润总量没有明显变化。与基质薄壁组织（stromal parenchyma）相比，CD8 T细胞浸润到肿瘤区域比例显著增加（p=0.024）。进一步实验发现EpCam（上皮细胞粘附分子）是一种I型跨膜糖蛋白，最初被鉴定为肿瘤相关抗原。EpCam肿瘤细胞上的MHC-I显示DMTi对肿瘤细胞上MHC-I的上调。这些数据表明DNMT1可能影响MHC-I启动子甲基化，并改变免疫微环境。鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G蛋白）成员之一的G蛋白亚基αO1（GNAO1）是一种肿瘤抑制蛋白，其失调可促进癌发生。一项研究表明，DNMT1介导的高甲基化启动子沉默GNAO1基因导致HCC发展。总之，上述研究表明DNMT1具有促癌作用，并可作为癌症治疗的潜在靶点。
（2）DNMT3A与癌症
DNMT3A基因位于2号染色体上，其蛋白质编码区为2172bp，编码约130 kDa蛋白。DNMT3A与DNA的结合主要由催化环（catalytic loop）目标识别结构域（TRD）和DNMT3A同型二聚体界面介导，共同构建连续的DNA结合表面。DNMT3A偏好未甲基化DNA，从而导致de novo甲基化。多项研究数据表明，两种DNMT3A单体可以在一次DNA结合事件中甲基化两个相邻的CpG二核苷酸。在癌症中，DNMT最常见的突变为DNMT3A突变，DNMT3A过表达与外阴鳞状细胞癌、垂体腺瘤和结直肠癌（CRC）的高侵袭性和迁移性等恶性特征相关。
DNMT3A过表达和缺失都有利于促进肺癌发展。到目前为止，越来越多的证据表明包括miR-708-5P和miR-101在内的miRNA在癌症进展中发挥作用并参与癌症过程。Liu等人的实验表明DNMT3A蛋白翻译被作为保护因子的miR-708-5P抑制，降低了NSCLC细胞的致瘤性。而miR-101在人类癌症中经常沉默，但在过表达时表现出抗肿瘤特性。然而DNMT3A消除了miR-101对肺癌细胞侵袭性迁移的抑制作用，还破坏了miR-101活化的caspase-3（一种凋亡酶），这导致了对NSCLC增殖的抑制。此外，在几乎无创性肺腺癌中表现出DNMT3A的显著过表达，这些亚型的预后相对优于其他亚型。验证了DNMT3A在肺腺癌中的下调可能与预后不良有关。DNMT3A缺失促进了小鼠模型中肺癌进展，表明DNMT3A可能作为TSG来抑制可能导致肺癌的进展。在另一项研究中，CD147与化学耐药性和侵袭性密切相关，并刺激透明质酸合成，从而影响癌症微环境。最新研究Liao等人提出DNMT3A相关的靶向甲基化系统下调CD147表达水平并抑制NSCLC侵袭和转移。
除了在肺癌中的作用外，DNMT3A由于其在结直肠癌（CRC）组织中的过表达而引起了广泛关注。在一项关于胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）治疗CRC的分子机制的研究中，发现TDG可通过抑制CRC迁移和侵袭来结合并促进DNMT3A的泛素化和降解。同时，靶向DNMT3A mRNA的3'-UTR会降低DNMT3A的蛋白质水平并抑制CRC细胞的增殖、迁移和侵袭。
在关于DNMT3A在AML中促癌作用的重要分析和讨论中，Chen等人揭示了CEBPA与DNMT3A N末端（DNMT3A1富集区域的正常发育和DNA甲基化所需的结构）相互作用，以阻止DNMT3A结合DNA并催化CpG甲基化。一旦CEBPA发生癌相关突变，就会解除DNMT3A抑制并促进AML。但DNMT3A在血液系统恶性肿瘤中也是一种肿瘤抑制因子，因为DNMT3A缺失模型在获得协同突变后可能会发展成致命的血液系统恶性肿瘤，DNMT3A对CpG岛的高甲基化可能代表限制增殖和/或异常自我更新失败的残余痕迹。
总体而言，DNMT3A可能既可以作为促癌基因，也可以作为抑癌基因。这种矛盾效应促使更多的研究人员专注于DNMT3A的探索，这有助于肿瘤靶向治疗的进一步发展。
