重组腺病毒构建，扩增及纯化基本技术操作
重组DNA技术可以用于：（1）据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的；（2）是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一，即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。
| 实验方法原理 | Adeasy系统利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度浓缩等优点，并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1，使之成为较为安全、高效的病毒载体。利用带有 E1 基因的 293 细胞作为包装细胞，通过倍比扩增，富集病毒颗粒，并通过CsCl 梯度离心，透析进行分离纯化。对绝大多数的细胞株可以达到近乎100％的感染效率。但需要指出的是 Adeasy 同样具有所有病毒载体或转染试剂都不可避免的细胞毒性问题。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | PmeI酶琼脂糖LB培养基甘油液氮SOC卡那霉素PacI酶Lipofectamine无血清培养基DMEM完全培养基PBSCsCl病毒裂解上清液矿物油 |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、目的基因的克隆（以pshuttle-CMV质粒为例） 1. 选择适当酶切位点，进行酶切连接，将目的片段插入pshuttl-CMV质粒多克隆位点。 2. 重组质粒鉴定： 酶切鉴定或测序。 3. 重组质粒扩增，纯化并准备适量含目的基因的穿梭质粒。 4. 用PmeI单酶切线性化重组穿梭质粒，电泳鉴定质粒完全被切开。 5. 胶回收线性化质粒，以备共转化使用。 二、共转化 1 大肠杆菌BJ5183电转感受态制备 1) 从新鲜琼脂板上挑取单个BJ5183细菌，接种于LB培养基中，37℃振摇过夜。 2) 接种25ml过夜培养物于500ml LB培养基，37℃振摇，至OD600 达到0.4。 3) 迅速将培养物置于冰浴中30min，至充分冷却。 4) 将菌液转移至预冷的离心管中，4℃下以2500r/min离心15 min，弃培养液，回收细胞。 5) 以10ml预冷的10%甘油洗涤沉淀，低温离心，共两次。 6) 加约1ml（适量）预冷的10%甘油重悬沉淀，稀释悬液100倍，测量OD600，至稀释浓度为2-3×1010个细胞/ ml （1.0 OD600约2.5×1010个细胞/ml）。分装，-80℃或液氮保存待用。 2 病毒骨架质粒转化大肠杆菌，扩增，纯化。 3 将1-5µl （约1µg） 线性化的穿梭质粒及1µl（约100ng/µl）病毒骨架质粒（如pAdEasy-1）加入至含约40µl BJ5183电转感受态的EP管中混匀，冰上冷却。 4 将混合物加入电转杯，电击（1250-1500V/mm,5ms）。 5 电击结束取出样品，加入1ml SOC或LB培养液，37℃低速振荡40min。 6 取适当体积的电击转化细胞液涂于数个卡那霉素抗性平板（25-50mg/ml），37℃培养16-20hr。 7 次日挑取平板上长出的菌落（选择最小的菌落），接种于3ml含25-50mg/ml的LB培养基，37℃培养10-15hr。 8 碱裂法提取质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳筛选，大质粒为可能阳性克隆，进一步酶切鉴定。以PacI单酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳如显示出一条大片段（约30kb），及一条小片段（约3.0或4.5kb）（同时可进行其它酶切鉴定），则基本确定为阳性克隆。 9 取1-5µl 阳性质粒转化至DH5α大肠杆菌细胞（BJ5183为recA+,质粒DNA易发生突变，DH5α或JM109，XL1-blue菌株为重组缺陷性菌株，可稳定扩增已鉴定的重组质粒），扩增细菌并纯化质粒。 三 重组病毒质粒转导293细胞 1. 293细胞培养：转导24小时前，以方瓶为例，接种2×106 293细胞于25cm2方瓶，使生长密度约50-70%。（也可以使用6孔或96孔板） 2. 以PacI单酶切重组病毒质粒（转导25cm2方瓶约需4µgDNA），完全线性化后，乙醇沉淀，再以20 µl dd H2O溶解。 3. 脂质体包裹质粒（以Lipofectamine为例）：每4µg PacI约需20µl Lipofectamine包裹。质粒及脂质体分别稀释于500µl无血清培养基再混合，置于室温下15-30min。 4. 以无血清培养基轻轻洗涤培养瓶，另加2.5ml无血清培养基，37℃放置10min。 5. 将Lipofectamine-DNA混合物加入培养瓶，37℃孵箱放置4hr。 6. 4hr后，弃Lipofectamine-DNA混合液，另加入6ml DMEM完全培养基（含10% FCS）。如有大量细胞漂浮，可不弃Lipofectamine-DNA液，加入6ml DMEM完全培养基，37℃孵育过夜，再换液。 7. 培养过程中观察细胞生长情况。约2周后可观察到细胞病变（CPE）出现（如用pAdTrack-CMV质粒，由于含GFP，可观察到绿色荧光）。 四 重组病毒鉴定 1. 转导10-14d后，收集细胞沉淀，加入2ml灭菌的PBS混悬，冻融细胞，离心后收集上清保存于-80℃。 2. 取30-50% 步骤1中上清，感染50-70%饱和度的25cm2方瓶中293细胞。2-3d后出现明显细胞病变。 3. 感染后3-5d,当1/3-1/2细胞漂浮时收集病毒。按步骤1收集细胞并准备病毒上清。通过Western blot和/或PCR鉴定重组腺病毒产生。 4. PCR鉴定重组病毒。取5µl病毒上清加入10µl蛋白酶K，55℃孵育1hr，再煮沸5min，离心后取1-2µl作PCR。 五 重组病毒扩增，纯化 1. 75cm2方瓶中接种293细胞，至密度达到90%，加入适量病毒上清感染细胞。3-4d后，细胞几乎变圆，且有一半细胞漂浮，则收集所有细胞。约500g转速离心，弃上清。 2. 以灭菌PBS重悬沉淀，反复冻融4次。4℃下7000g离心5min.病毒纯化至少需要30瓶75cm2方瓶细胞。 3. CsCl连续梯度离心纯化：50ml离心管中称量4.4g CsCl，加入8ml病毒裂解上清液，混匀，体积约为10ml。转移至12ml超速离心管（用于SW41转头）中，覆盖约2ml矿物油。平衡后，10℃下32000 rpm离心18-24hr，用注射器抽吸离心出的病毒带。 （也可CsCl不连续梯度离心：20ml超速离心管中缓慢加入8ml CsCl 1.4 （53 g + 87 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9），上面小心加入6 mL CsCl 1.2 （26.8 g + 92 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9），再小心加入病毒上清液至体积达到20ml。平衡后，4℃下 23000rpm离心90min （SW28转头），用注射器抽吸下层蓝白色病毒带） 4 病毒透析去盐：配置透析液（10 mM Tris pH 8.0, 2 mMMgCl2, 5% sucrose），灭菌处理。4℃透析，更换3次透析液，可基本去除CsCl，病毒保存于-80℃。 六 病毒滴度测定（TCID50） 1. 细胞准备：96孔板中接种100µl 293细胞，每孔细胞数约104个，以2% DMEM培养 2. 稀释病毒液准备：以2% DMEM将病毒液稀释成8个较高浓度（如10-3-10-10），每个浓度重复10个，每孔加入病毒稀释液100µl。另留两排不加病毒液作为阴性对照。37℃下，孵箱培养10天。 3. 10d后观察细胞，记数每排出现CPE的孔数，计算细胞病变率。（如某一浓度各孔细胞全部病变，比率为1，如无细胞病变，则比率为0）。 4. 计算T =10×101 + d （S - 0.5） /ml d = Log 10 稀释度（如为10倍稀释℃，d=1） S = 各浓℃细胞病变比率之和 实验室重组腺病毒常用质粒：病毒骨架质粒：pAdEasy-1, pAdEasy-2 穿梭质粒：p-Shuttle, p-Shuttle-CMV, pAdTrack, pAdTrack-CMV 展开 |
| 注意事项 | 也可CsCl不连续梯度离心：20ml超速离心管中缓慢加入8ml CsCl 1.4 (53 g + 87 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9)，上面小心加入6 mL CsCl 1.2 (26.8 g + 92 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9)，再小心加入病毒上清液至体积达到20ml。平衡后，4℃下 23000rpm离心90min (SW28转头)，用注射器抽吸下层蓝白色病毒带。 |
| 其他 | 腺病毒是一长约 36kb 双链、无包膜的 DNA 病毒，具有易感染、易获得、且能感染多种细胞等特点; 腺病毒不整合到染色体 DNA 中，因而不会带来严重的副作用，可用于体内外基因治疗、基因转导等研究。 |
