蛋白质组学研究选材四大原则
中国饮食文化博大精深，《舌尖上的中国》向世界展示了我们这个完美的吃货民族。一道成功佳肴，食材挑选有着非常严格的标准。在医学基础研究领域，实验与做菜亦有共通之处，做饭时如果偷懒，用煮过面条的汤煮馄饨，馄饨的卖相口感观感都大为降低。实验也如此，一是一，二是二，必要精确审慎，更不可以偷懒，变通条件。偷工减料一时爽，数据糟糕难重复，山寨病毒虽省钱，博士延期哭成狗。
做菜最重要的便是原材料的品质，放到嘴里之前，你永远不知道这道菜味道正不正，但新鲜优质的食材至少能提高这道菜的成功率，毕竟臭鱼永远无法煲出鲜汤。蛋白质组学研究亦如此，无污染无降解的合格样本是找到靠谱差异蛋白的前提！本期黄博即向大家介绍定量蛋白质组学高通量筛选技术中的一道硬菜——iTRAQ联合串联质谱技术——的样本选材。
iTRAQ 定量分析蛋白质的基本原理是利用iTRAQ试剂是可与氨基酸末端氨基及赖氨酸侧链氨基以共价键链接从而完成对肽段的标记，经过高效液相色谱分离，一级质谱和二级质谱分析，即可完成对样本中蛋白质的定性与相对定量。理论上讲iTRAQ实验每个样本需要的蛋白量至少300ug，然而实际上只要做过实验的人都能应该都能理解所有实验的成功率并非100%，特别对于iTRAQ这种流程复杂、对仪器稳定性依赖高的实验，因此保守起见，每次实验之前准备的蛋白量最好满足两次独立实验，此为其一。其二，是样本准备阶段，单纯从实验技术角度出发，只要能从样本中提出蛋白即可进行iTRAQ实验，但对于实验的目来说，我们收集的样本是否真的符合要求？不一定！特别是对于临床收集的样本。
iTRAQ的优点之一是样本来源广泛，几乎所有收集的样本都可利用该技术进行蛋白质组的筛选，不管是寻找功能蛋白质、机制的探索，还是疾病Biomarker的筛选，一网打尽，尽快将样本转化成研究成果，避免这些珍贵的样本在冰箱中睡大觉。
样本形式多种多样，组织、细胞、血液（血清或血浆）、脑脊液、尿液、骨关节滑液……不同样本收集方法不尽相同，需要有针对性的protocol，总体来说，需满足以下几条：
代表性原则：取样的代表性关系到实验结果是否具有科学意义，因此您应该根据实验目的慎重选择您的取样方案。实验与对照的样本之间不能有污染，有条件时，应做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致，否则可能会影响实验结果的可信度。体液样本需要通过分步离心（或滤膜）去除其中细胞、细胞碎片及细菌等干扰因素。另外非常重要的一点是不同样本来源的蛋白质组是不一样的，甚至同一组织中不同细胞之间的差异都会很大，这两中样本之间做定量是没有可比性的，因此在设计实验准备样本的时候一定要考虑生物实验中的单一变量原则。
准确性原则：代表性样本的各种特征数据必须被准确记录，并按要求（低温、迅速）采集、制备、贮存、运输，最终正确地按实验设计进行实验和数据处理。此外，详细临床数据（包括病理数据、预后随访数据等）的积累是保证数据分析结果的临床意义的重要因素。
时效性原则：样本质量是各类检测实验中影响实验结果的关键因素，因此用于研究的样本，在采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地做到迅速，最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。尤其要注意胰腺这类易降解样本，以及尿液这类易受微生物污染的样本。
低温原则：样本收集后，做好标记与记录，尽快液氮速冻，然后于-80℃冰箱中保存，干冰寄送，整个过程需避免样本反复冻融，以防止蛋白质的降解。但不要过于信赖-80°冰箱，即使冰箱的温度波动平稳，保存其中的样本仍然会发生缓慢降解，一般建议蛋白质组学研究的样本不要保存超过一年，长时间保存的样本需要经过质检确定是否还能用。
为确保实验的顺利，强烈建议在取样时，应同时备份，做一份，留一份，以防部分样本降解，重新取材耽误时间。即使样本全部合格，备份的样本还可以用来进行其他方面的实验（如定量验证，蛋白方面，生化方面的实验等）。备份分为两种，一种为严格备份，即：样本取下后一分为二，这样的两份样本基本上具备同性质。另一种为非严格备份，即生物学重复的样本，这样的备份样本同质性要较前者差。
最后，针对于iTRAQ实验，不同的实验方案设计，不同的样本收集方法，黄博都备有相应私货，欢迎大家戳微信私聊。
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