利用PCR技术诊断遗传病的途径和方法
(一)PCR技术直接诊断遗传病
对于由基因缺失突变引起的遗传病可利用缺失区域还侧的DNA序列引物直接扩增 该区域,看有无特异性的扩增产物,这对缺失部位固定的片段检测非常准确简便,只 需一对引物即可完成,而对于哪些缺失部位异质的基因则可利用多对引物进行多重 PCR,然后检查缺失带.对基因的重排来说,可通过用RT-PCR检测mRNA的融合情况来检 出,括入亦可用PCR方法来检出,当点突变影响到限制内性切酶切点时,可用PCR-RFL P进行分析,即将扩增产物用适当的内切酶切割,然后据电泳图谱复制判断有无内切 酶切点的改变,它比传统的RFLP检测法快速简便,且不受同位素的危害.若突变优点 及性质已知.可用PCR-ASO,3'特异PCR及引物镱争法进行确定,而对于突变优点不清 楚或突变优点多变的基因则可用PCR-SSCP,DGGE,CDGE,TGGE,PCR-RNSE切割,化简 错配切割,异源双链分析长久法进行筛选与遗传病有关的点突变,再用PCR循环直接 测序确定突变部位和性质.
(二)利用连锁分析间接诊断遗传病
在有的遗传病其基因结构庞大,基因的分子病理改变复杂或不清楚,或异质性较 高,利用PCR技术直接检测与遗传病有关的基因点突变有一定的困难.常常利用一些基 因内或其旁侧的一些多态性标记进行连锁分析,以间接判断遗传病,常以PCR方法进 行检测的多态性标记有以下两种.
1.PCR-RFLP
在人类基因组中存在着许多限制性内切酶切点,这些切点在人群中具有明显的遗 传变态性.因此可用已知DNA序列的基因内或其旁侧序列中的酶切位点多态性以PCR方 法来检测.PCR扩增后用相应的内切酶进行切割相应的扩增产物,通过用琼脂糖蔌聚丙 烯胺凝胶电泳技术进行电泳,分析酶切位点多态性,在家庭或黄间进行连锁分析.需 要注意的是,在用PCR-RFLP进行连锁分析时应选择那些杂合频率多,即具有较高多态 信息量的酶切位点多态性.亦可采用多个多生酶切位点联合应用.
2.Amp-FLP
在人类基因组中,除RFLP可作为遗传标记外还有一有用的多态性标记,即VNTR(数 目可变的串联重复序列,和STR(短的串联重复序列).VNTR的特征是其重复的核心区内 的串联重复单位为6-40nt,重复次断在不同个体有所不同重复次数变化亦较大,一般 在几次到上每次之间.STR的核心重复单痊为2-5时,其中由双核苷酸重复(CA)n或(GT) n(n从10-60次)构成的串联重复称为VNDR.有意义的是,这些串联重复序列在人群中具 有高度的遗传多态性,人群中的杂合子比例在50%以上,最高的可达90%以上,因此它 仍可提供更多的多态信息量.VNTR和STR可用其两端的序列合成引物,用PCR进行扩 增,PAGE+银染坚尔比即Amp-FLP,加之这些片段呈孟德尔或遗传,因此用之作为连 锁分析的标记具有重要价值.目前Amp-FLP已广泛应用多种遗传病的连锁分析如DMD/B MD,DKU等.最近几年的研究还发现,已可是核苷酸重复的长度变异可导致许多人类疾 病.目前已证实的的与人类疾病有关的致病性重复之联核苷酸有脆性×染色体综合征 (CGG)>52,肌强直性营养不良DM(CTG)>50;×连锁脊髓和延髓肌萎缩(CAG)HD(CAG)当. 利用串联重复区所测序列合成的引物即可对这些遗传病时行基因诊断.
