微生物学检验基本技术（四）
三、碳源和氮源利用试验
1．枸橼酸盐利用试验
(1)原理：某些细菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，而在此培养基上生长，并分解枸橼酸盐生成碳酸钠，使培养基变碱性。。
(2)方法：将待检菌接种于枸橼酸盐培养基上，置35℃孵育1~4d，逐日观察结果。
(3)结果：若用溴麝香草酚兰指示剂，斜面出现菌落或菌苔，培养基变蓝色为阳性；无菌落生长，培养基绿色为阴性。
(4)应用：可用此试验作细菌种属间鉴定。埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常阳性，粘质和液化沙雷菌和某些变形杆菌及枸橼酸杆菌阳性。此外，铜绿假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌和嗜水气单胞菌也能利用枸橼酸盐。
2．丙二酸盐利用试验
(1)原理：某些细菌能利用丙二酸盐作为唯一碳源，丙二酸盐被分解生成碳酸钠，使培养基变碱。
(2)方法：将待检菌接种于丙二酸盐培养基中，置35℃孵育24~48h，观察结果。
(3)结果：培养基由绿色变为蓝色为阳性。颜色无变化为阴性。
(4)应用：肠杆菌科中亚利桑那菌和克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属有不同生物型反应，其它各菌属均为阴性。
3．醋酸钠利用试验
(1)原理：细菌利用铵盐作为唯一氮源，同时，利用醋酸盐作为唯一碳源时，可在醋酸盐培养上生长，分解醋酸盐生成碳酸钠，使培养基变为碱性。
(2)方法：将被检菌接种于醋酸盐培养基中，置35℃孵育2~7d，逐日观察结果。
(3)结果：培养基上有细菌生长，并变为蓝色为阳性。
应用：主要用于大肠埃希菌和志贺菌属的鉴别，前者为阳性，而后者为阴性。
4．马尿酸钠水解试验
(1)原理：某些细菌可具有马尿酸水解酶，可使马尿酸水解为苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸与三氯化铁试剂结合，形成苯甲酸铁沉淀。
(2)方法：将待检菌接种于马尿酸钠培养基中，置35℃孵育48h，离心沉淀，取上清液0.8ml，加入三氯化铁试剂0.2ml，立即混匀，经10~15min观察结果。
(3)结果：出现恒定之沉淀物为阳性。
应用：主要用于B群链球菌的鉴定。
5、乙酰胺利用试验
(1)原理：许多非发酵菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，使培养基变碱。
(2)方法：将被检菌接种于乙酰胺培养基中，置35℃孵育24~48h，观察结果。
(3)结果：培养基由绿色变为蓝色为阳性。如不生长，或稍有生长，但培养基颜色不变为阴性。
(4)应用：主要用于非发酵菌的鉴定。铜绿假单胞菌、去硝化产碱杆菌、食酸假单胞菌为阳性，其它非发酵菌大多数为阴性。四、酶类试验
1.氧化酶试验
(1)原理：氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶。此酶并不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。因此，本试验结果与细胞色素C的存在有关。
(2)方法：取洁净滤纸条，沾取菌落少许，加氧化酶试剂（10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液或10g/L盐酸二甲基对苯二胺水溶液）1滴，1min内观察结果。也可将试剂滴加到菌落上进行试验。
(3)结果：阳性者立即变粉红色，5~10s内呈深紫色。无色为阴性。
(4)应用：用于奈瑟菌属的菌种鉴定，该属细菌均阳性。此外，也用于假单胞菌属与肠杆菌科细菌的区别，前者阳性，而后者阴性。莫拉菌属、产碱杆菌属等均为阳性。
注意事项： ①试验时应避免接触含铁物质，以免出现假阳性。②10g/L盐酸四甲基对苯二胺或10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液为无色溶液，在空气中易被氧化而失效，故应经常更换新试剂，并盛于棕色瓶中，若试剂已变成深蓝色，应弃去不用。
2．触酶试验
(1)原理：触酶又称过氧化氢酶，具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而形成氧分子，出现气泡。
(2)方法：取洁净玻片1张，用接种环挑取细菌，加3％H2O2 1滴，立即观察结果。
(3)结果：若立即出现大量气泡为阳性。无气泡为阴性。
(4)应用：大多需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，但链球菌科阴性，故常用此试验来鉴定。此外，金氏杆菌属的细菌也为阴性。分枝杆菌的鉴别则用耐热触酶试验，结核分枝杆菌为阴性，戈氏分枝杆菌和地分枝杆菌为阳性。
注意事项：①3％H2O2溶液要新鲜配制。②不宜用血琼脂平板上生长的菌落，因红细胞含有触酶，可致假阳性反应，③取对数生长期的细菌。
3．凝固酶试验
(1)原理：凝固酶试验是鉴定葡萄球菌致病性的重要试验。致病性葡萄球菌可产生两种凝固酶，一种是与细胞壁结合的凝聚因子，称结合凝固酶，它直接作用于血浆中纤维蛋白原，使发生沉淀，包围于细菌外面而凝聚成块，玻片法阳性结果是由此凝聚因子所致；另一种凝固酶是分泌至菌体外，称为游离凝固酶，它能使凝血酶原变成凝血酶类产物，使纤维蛋白原变为纤维蛋白，从而使血浆凝固。试管法可同时测定结合型和游离型凝固酶。
(2)方法:
①玻片法：在一张洁净玻片中央加1滴生理盐水，用接种环取待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照）制成菌悬液，若经10~20s内无自凝现象发生，则加入人或兔新鲜血浆1环，与菌悬液混合，观察结果。②试管法：于试管内加1：4稀释的兔或人血浆0.5ml，再加1~2个待试菌菌落，置37℃水浴，每30min观察1次结果。
(3)结果：①玻片法：5~10s内出现凝集者为阳性。②试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳性。2h后无上述现象出现，则放置过夜后再观察。
(4)应用：本试验仅用于致病性葡萄球的鉴定。
注意事项：①玻片法为筛选试验，阳性、阴性均需进行试管法测定。②血浆必须新鲜。③应使用肝素而非枸橼酸盐作抗凝剂抗凝的血浆。④本试验也可用市购的胶乳凝集试验试剂盒测定。
4．DNA酶试验
(1)原理： 某些细菌能产生DNA酶，水解外源性DNA使之成为寡核苷酸。DNA可被酸沉淀，而寡核苷酸则不会。故在DNA琼脂平板上加盐酸后，可在菌落周围形成透明区。
(2)方法：在DNA琼脂平板上点种待检菌，35℃孵育18~24h，用1 mol/L盐酸倾注平板，观察结果。
(3)结果：如菌落周围有透明区者为阳性，无透明区为阴性。
(4)应用：主要用于肠杆菌科及葡萄球菌属某些菌种的鉴定。沙雷菌、变形杆菌和金黄色葡萄球菌DNA酶均阳性。
5．胆汁溶菌试验
(1)原理：胆汁或去氧胆酸钠能导致某些细菌溶解，一方面是由于胆汁或去氧胆酸钠降低了细菌细胞膜上的表面张力，使细菌的细胞膜破损或使菌体裂解。另一方面可能与激活细菌体内的自溶酶有关。
(2)方法：①试管法：用纯培养物制备1ml生理盐水浓菌悬液，pH调至7.0，分装两支试管，各0.5ml。其中一管加0.5ml
100g/L去氧胆酸钠为试验管，另一管加0.5ml生理盐水作对照。35℃孵育每小时观察1次结果。②平板法：在血平板上选取单个可疑菌落，作好标记，直接在菌落上加1接种环20g/L去氧胆酸钠（pH7.0），置35℃孵育30min（平板不要翻转）观察结果。
(3)结果：①试管法：在3h内液体透明为阳性。②平板法：如菌落消失，仅留下溶血区为阳性，菌落不消失为阴性。
(4)应用：用于肺炎链球菌的鉴定。
6．硝酸盐还原试验
(1)原理：硝酸盐还原反应包括两个过程，其一是在合成代谢过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其它含氮化合物；另一是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。硝酸盐还原过程可因细菌不同而异。有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌等；有的细菌可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如沙雷菌属；有的细菌还可以将其还原产物在合成性代谢中完全利用。硝酸盐或亚硝酸盐如果还原生成气体的终末产物如氮或氧化氮，则称为脱硝化或脱氮化作用。某些细菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者与α-萘胺结合生成N-α萘胺偶苯磺酸。
(2)方法：将待检菌接种于硝酸盐培养基（内含小倒管）中，35℃孵育1~4d。将甲、乙等量混合液（用时混合）0.1ml加于试管内，立即或10min内观察结果。
(3)结果：出现红色为阳性反应。如欲观察有无氮气产生，可于培养基管内加1只小倒管，有气泡产生，则表示有氮气生成。如欲检查培养基中硝酸盐是否被分解，可取锌粉少许加入培养基内，如出现红色表明硝酸盐仍存在；若不出现红色，表示硝酸盐已被分解。
(4)应用：本试验广泛用于细菌鉴定。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；假单胞菌属中有的细菌能产生氮气，如铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、斯氏假单胞菌，有的则能还原硝酸盐为亚硝酸盐，如鼻疽假单胞菌等；厌氧菌如韦荣菌也能还原硝酸盐为亚硝酸盐。
7．卵磷脂酶试验
(1)原理：细菌产生的卵磷脂酶，经钙离子作用，能迅速分解卵黄或血清中的卵磷脂形成混浊沉淀状的甘油酯和水溶性磷酸胆碱。
(2)方法：取待检菌划线接种或点种在卵黄琼脂平板上，置35℃孵育3~6h，观察结果。
(3)结果：3h后在菌落周围形成乳白色混浊，即为卵磷脂酶试验阳性，6h后该混浊圈可扩大到直径5~6mm。
(4) 应用：该试验主要用于厌氧的鉴定。产气荚膜梭菌和诺维梭菌为阳性，其他梭菌为阴性。蜡样芽孢杆菌亦为阳性。
8．磷酸酶试验
(1)原理：磷酸酶是磷酸脂的水解酶，可使单磷脂水解，其反应可根据反应基质不同而异，如用磷酸酚酞为基质，经磷酸酶水解后可释放酚酞，在碱性环境中呈红色。
(2)方法：取待检菌接种于磷酸酚酞琼脂平板上，置35℃孵育18~24h，于平皿盖内加1滴浓氨水，熏蒸片刻，观察结果。亦可用液体培养基，经孵育后，向管内加400g/L氢氧化钠溶液1滴，观察结果。
(3)结果：菌落变为红色者为阳性。
(4)应用：主要用于致病性葡萄球菌与非致病性葡萄球菌的鉴别，前者为阳性，后者为阴性。
