微生物学检验基本技术（五）
9．脂酶试验
(1)原理：细菌产生的脂酶可分解脂肪为游离脂肪酸。在培养基中加入维多利亚蓝可与脂肪结合成为无色化合物，如果脂肪被分解，则维多利亚蓝释出，呈蓝色。
(2)方法：将待检菌接种于含维多利亚蓝的脂酶培养基中，置35℃孵育24h，观察结果。
(3)结果：培养基变为深蓝色者为阳性，否则可呈无色或粉红色。
(4)应用：主要用于厌氧菌鉴定。在拟杆菌中产黑色素拟杆菌中间亚种产生脂酶，其它拟杆菌阴性；在梭菌属中诺维梭菌和产芽胞梭菌也产生此酶，其它梭菌为阴性。
10．CAMP试验
(1)原理：B群链球菌（无乳链球菌）产生一种“CAMP”因子，此种物质能促进葡萄球菌的β-溶血素的活性。因此，可在两种细菌的交界处溶血力增强，出现箭头型透明溶血区。
(2)方法：在羊血或马血琼脂平板上，先以β-溶血的金黄色葡萄球菌划一横线接种。再将待检菌与前一划线作垂直接种，两者应相距1cm，于35℃孵育18~24h，观察结果。每次试验应做阴阳性对照。
(3)结果：两种细菌划线交接处出现箭头型溶血区为阳性。
(4)应用：主要用于B群链球菌（阳性）的鉴定，其他链球菌均为阴性。
11．石蕊牛乳试验
(1)原理：由于牛乳内含有丰富的蛋白质和糖类，各种细菌对这些物质的分解能力不同，故可有数种不同反应，用以鉴别细菌。
(2)将待检菌接种于石蕊牛乳培养基中，若为芽胞梭菌，要在培养基中加入无菌铁末，置35℃孵育18~24h，必要时可延长至14d。观察结果。
(3)结果：①产酸：发酵乳糖产酸，使指示剂变为粉红色。②产气：发酵乳糖而同时产气，可冲开上面的凡士林。③凝固：因产酸太多而使牛乳中的酪蛋白凝固。④胨化：将凝固的酪蛋白继续水解为胨，培养基上层液体变清，底部可留有未被完全胨化的酪蛋白。⑤产碱：乳糖未发酵，因分解含氮物质，生成胺及氨，培养基变碱，指示剂变为蓝色。
(4)应用：主要用于梭菌、链球菌和丙酸杆菌的鉴定。
五、抑菌试验
1．Optochin敏感试验
(1)原理：Optochin(奥普托欣)是盐酸乙基氢化羟基奎宁的商品名。对肺炎链球菌有特异抑制作用，其作用机制可能是干扰叶酸生物合成作用，而对其它链球菌则无此作用。
(2)方法：用棉拭子将待检菌的肉汤培养物均匀涂布于血琼脂平板上，贴上一张含5μg奥普托欣纸片，置烛缸或二氧化碳孵箱，35℃ 孵育18~24h，观察结果。
(3)结果：抑菌圈直径大于14mm为敏感，小于或等于 14mm为阴性。
(4)应用：主要用于肺炎链球菌（敏感）与其它链球菌（耐药）的鉴别。
2．杆菌肽敏感试验
(1)原理：A群链球菌对杆菌肽几乎是100%敏感，而其它群链球菌对杆菌肽通常耐药。故此试验可对链球菌进行鉴别。
(2)方法：用棉拭子将待检菌的肉汤培养物均匀涂布于血琼脂平板上，稍干后贴一张含0.04U的杆菌肽纸片，置35℃ 孵育18~24h，观察结果。
(3) 结果：抑菌圈直径大于10mm为敏感，小于10mm为耐药。
(4)应用：主要用于A群与非A群链球菌的鉴别。从临床分离的菌株中有5%~15%非 A群链球菌也对杆菌肽敏感，如6%的B群链球菌、7.5%的C群链球菌和G群链球菌等。
3．新生霉素敏感试验
(1)原理：金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌可被低浓度新生霉素所抑制，表现为敏感，而腐生葡萄球菌则表现为耐药。
(2)方法：用棉拭子将待检菌菌悬液均匀涂布于M-H琼脂平板或血平板上，在平板中央贴含5μg/片新生霉素诊断纸片一张，置35℃孵育16~18h，观察结果。
(3)结果：抑菌圈直径大于16mm为敏感，小于或等于16mm为耐药。
(4)应用：主要用于葡萄球菌某些种的鉴定。
4．O/129试验
(1)原理：O/129（2，4二氨基-6，7-二异丙基喋啶）能抑制弧菌属、发光杆菌属和邻单胞菌属细菌生长，而气单胞菌属和假单胞菌属细菌则耐药。
(2)方法：用棉拭子将待检菌菌悬液均匀涂布于碱性琼脂平板上，将10μg/片及150μg/片的O/129诊断纸片贴于平板上，置35℃孵育18~24h，观察结果。
(3)结果：出现抑菌圈者表示敏感，无抑菌圈者为耐药。
(4)应用：主要用于弧菌属、邻单胞菌属与气单胞菌属的鉴别，弧菌属和邻单胞菌属菌为敏感，气单胞菌属菌为耐药。其它菌属有发光杆菌属为敏感，假单胞菌属为耐药。
5．氰化钾试验
(1)原理：氰化钾可抑制某些细菌的呼吸酶系统。细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶均以铁卟啉作为辅基，氰化钾与铁卟啉结合，使这些酶失去活性，使细菌生长受到抑制。
(2)方法：将待检菌接种于氰化钾培养基中，同时接种一支不含氰化钾的对照培养基，置35℃孵育24~48h，观察结果。
(3)结果：细菌在氰化钾培养基中生长的（不受抑制）为阳性，不生长（抑制）为阴性。
(4)应用：肠杆菌科中的沙门菌属、志贺菌属和埃希菌属细菌的生长受到抑制，而其它各菌属的细菌均可生长。
六、其它试验
1．克氏双糖铁或三糖铁琼脂培养基试验
(1)原理：克氏双糖铁(KIA)或三糖铁琼脂(TSI)培养基制成高层和短的斜面，其中葡萄糖含量仅为乳糖或蔗糖的十分之一，若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖和蔗糖，分解葡萄糖产酸使pH降低，因此斜面和底层均先呈黄色，但因葡萄糖量较少，所生成的少量酸可因接触空气而氧化，并因细菌生长繁殖利用含氮物质生成碱性化合物，使斜面部分又变成红色；底层由于处于缺氧状态，细菌分解葡萄糖所生成的酸类一时不被氧化而仍保持黄色。细菌分解葡萄糖、乳糖或蔗糖产酸产气，使斜面与底层均呈黄色，且有气泡。细菌产生硫化氢时与培养基中的硫酸亚铁作用，形成黑色的硫化铁。
(2)方法：用接种针挑取待检菌的菌落，先穿刺接种到KIA或TSI深层，距管底3~5mm为止，再从原路退回，在斜面上自下而上划线，置35℃孵 育18~24h，观察结果。
(3)结果：常见的KIA反应有如下几种：
①斜面碱性/底层碱性：不发酵碳水化合物，系不发酵菌的特征。如铜绿假单胞菌。②斜面碱性/底层酸性：葡萄糖发酵、乳糖（和TSI中的蔗糖）不发酵，是不发酵乳糖菌的特征，如志贺菌。
③斜面碱性/底层酸性（黑色）：葡萄糖发酵、乳糖不发酵并产生硫化氢，是产生硫化氢不发酵乳糖菌的特征。如沙门菌、亚利桑那菌、枸橼酸杆菌和变形杆菌等。
④斜面酸性/底层酸性：葡萄糖和乳糖（和TSI中的蔗糖）发酵，是发酵乳糖的大肠菌群的特征，如大肠埃希菌、克雷伯菌属和肠杆菌属。
(4)应用：鉴别肠道杆菌用。KIA或TSI对初分离出的、可疑为革兰阴性杆菌鉴定特别有用。其反应模式是许多杆菌鉴定表的组成部分，也可作为观察其他培养基反应的有价值的质控依据。
2．氢氧化钾拉丝试验
(1)原理：革兰阴性细菌的细胞壁在稀碱溶液中易于破裂，释放出未断裂的DNA螺旋，使氢氧化钾菌悬液呈现粘性，可用接种环搅拌后拉出粘丝来，而革兰阳性细菌在稀碱溶液中没有上述变化。
(2)方法：取1滴40g/L氢氧化钾水溶液（应新鲜配制）于洁净玻片上，取新鲜菌落少许，与氢氧化钾水溶液搅拌混匀，并每隔几秒钟上提接种环，观察能否拉出粘丝。
(3)结果：用接种环拉出粘丝者为阳性，仍为混悬液者为阴性。
(4)应用：主要用于革兰阴性菌与易脱色的革兰阳性菌的鉴别。大多数革兰阴性菌于5~10s内出现阳性反应，有的则需30~45s，假单胞菌、无色杆菌、黄杆菌、产碱杆菌、莫拉菌等大多数在10s内呈阳性，不动杆菌、莫拉菌反应较慢，大多数菌株在60s内出现阳性，而革兰阳性菌在60s以后仍为阴性。
第四节 血清学试验
血清学试验是根据抗原与相应的抗体在适宜的条件下，能在体外发生特异性结合的原理，用已知抗体或抗原来检测未知抗原或抗体。因抗体主要存在于血清中，抗原或抗体检测时一般都要采用血清，故体外的抗原抗体反应亦称为血清学试验或血清学反应。血清学试验包括血清学鉴定和血清学诊断。血清学鉴定即用含已知特异性抗体的免疫血清(诊断血清)去检测患者标本中或培养物中的未知细菌或细菌抗原，以确定病原菌的种或型。血清学诊断是指用已知抗原检测病人血清中的相应抗体，以诊断感染性疾病的方法。血清学试验是临床微生物学检验的重要方法之一。血清学试验基本类型包括凝集反应、沉淀反应和补体结合反应等。
一、凝集反应
颗粒性抗原（细菌、红细胞、乳胶等）与相应抗体可发生特异性结合，在一定条件下（电解质、pH、温度、抗原抗体比例适合等）出现肉眼可见的凝集小块，称为凝集反应。参与反应的抗原称凝集原，抗体称为凝集素。凝集反应可分为直接凝集反应和间接凝集反应两大类。
(一)直接凝集反应
直接凝集反应指颗粒性抗原与相应抗体直接结合出现的凝集现象。
1. 玻片凝集试验
是一种定性试验。用己知抗体(诊断血清)测未知抗原，适用于细菌的鉴定或分群（型）等。方法是取已知抗体（诊断血清）滴加在载玻片上，直接从培养基上刮取待检菌混匀于诊断血清中，数分钟后，如出现细菌凝集成块或肉眼可见的颗粒，即为反应阳性。自临床初分离的细菌中，有些细菌表面含有某种表面抗原(如伤寒沙门菌的Vi抗原和志贺菌属的K抗原等)，这些抗原能阻止菌体抗原(O抗原)与相应抗体发生凝集反应，从而导致错误的判定。此时应将菌悬液于100℃中隔水煮沸(Vi抗原100℃30min
、 K抗原100℃ 1h)，待细菌表面抗原破坏后，再进行试验。
凝集试验简便、快速、特异性强，常用于沙门菌、志贺菌、致病性大肠埃希菌、霍乱弧菌、布氏杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌及链球菌等的鉴定。
2．试管凝集试验
为半定量试验。用等量抗原(细菌)悬液与一系列递倍稀释的抗血清混合，37℃保温4h后放室温或4℃冰箱过夜，观察结果。根据每管内抗原的凝集程度判定血清中抗体的相对含量。以血清最高稀释度仍有明显凝集现象者，为该血清中抗体的凝集效价，以表示血清中抗体的相对含量。
本法常用于测定免疫血清的效价、抗原的凝集性能；在临床上主要用于检测受试者血清中有无某种特异性抗体及其相对含量。如诊断伤寒、副伤寒的肥达反应、诊断布氏杆菌病的瑞特反应等。
(二)间接凝集反应
是将可溶性抗原或抗体吸附于某种与免疫无关一定大小的颗粒载体表面，制成致敏载体，再与相应抗体或抗原作用，在电解质存在的适宜条件下，被动地使致敏载体凝集，称为间接（或被动）凝集反应。
可用红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭等颗粒作载体，分别称间接血凝、间接乳凝、间接炭凝试验。由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积，当颗粒上的抗原与少量抗体结合后，就能出现肉眼可见的反应，故可提高反应的敏感性。常用间接凝集反应来测定待检血清中细菌、病毒、螺旋体、寄生虫等抗原及自身抗体。间接凝集反应又可分为如下3种。
正向间接凝集试验
即将已知可溶性抗原吸附于载体颗粒上，然后与相应抗体结合产生颗粒凝集现象，用以检测未知抗体。
反向间接凝集试验
是将已知抗体吸附于载体颗粒表面，以检测相应可溶性抗原的凝集反应。适用于可溶性和颗粒性抗原的检出，如反向间接血凝试验检测乙型肝炎表面抗原及甲胎蛋白，协助诊断乙型肝炎和原发性肝癌。从食品中检出肉毒毒素和葡萄球菌肠毒素等。
间接凝集抑制试验
是将已知抗体或可溶性抗原先与被测的抗原或抗体混合，然后加入有关抗原或抗体致敏的载体颗粒，如已知抗体或可溶性抗原与被测的抗原或抗体相结合，则不出现颗粒凝集现象。故也可称为正向间接凝集抑制试验或反向间接凝集抑制试验。
协同凝集试验
协同凝集反应属于间接凝集反应的一种类型。它所用的载体是含SPA（葡萄球菌A蛋白）金黄色葡萄球菌。
SPA能与人及多种哺乳动物血清中IgG类抗体的Fc段结合，IgG的Fc段与SPA结合后，IgG的两个Fab
段暴露于葡萄球菌菌体的表面，并仍保持正常的抗体活性，当结合于葡萄球菌表面的已知抗体与相应细菌、病毒或毒素抗原接触时，则出现肉眼可见的凝集现象。方法简便、快速、敏感性高，易于观察结果，已广泛用于细菌的快速鉴定和分群（型），如脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、布鲁氏菌、沙
门菌及志贺菌等细菌。
