外周血细胞形态学检验及诊断技巧（三）
四、血细胞形态学采样、制片染色与检查要求：
(一) 采样、制片及染色，三道工序至关重要：是细胞形态学检查的成败关键。要得到合格的涂片标本，做好上述工序，应注意以下要求：
采样、制片：
●玻片要求：国内1.0mm×26mm×76mm±0.5，美国NCCLS规定1.0mm×25mm×75mm±0.5，要严格清洁，接近中性.
●推片：选择优质推片，推片两端边缘整齐、平滑。也可选用有机玻璃，其大小、厚度与坡片相同，两端之边缘应加工光滑，以利推片用。
●采外周血（样），擦去第一滴血，迅速采血，量适中，如绿豆粒大小，具有一定推片技术，推片倾斜45°±，推成血膜长度25mm～35mm，宽度18～20mm，血膜四周留有空隙区，血膜终尾离玻片终端至少10mm，血膜均匀，薄如蝉翼，尾端形如弧状，迅速扇（摇）干，血膜具有头、体、尾不同厚薄区域。此外，涂片时，还要考虑患者的血液状态，如贫血程度、血液粘稠度、WBC或有核细胞多少等因素，调整推片技巧。
2．涂片染色：是识别细胞形态的重要标记工序：
（1）常规瑞氏-姬姆萨染色要点：
●要得到满意、漂亮的血细胞涂片染色标本，新鲜涂片迅速染色是很重要的。
●染色液配制要合格；
●涂片切勿用甲醛固定，否则不着色；
●染色的好坏与染色液、缓冲液的质量及比例、加液间隔时间、保持玻片染色液面的张力等染色技巧均有重大关系。染液要覆盖涂膜面，再加缓冲液（1:2），其量要充足、混均，染色时间要30分钟以上。
（2）细胞着色的观察：
●当染液与缓冲液混合后，甲醛吸水液温升高，发生剧烈反应，直至液膜表面的“染色粒”呈均匀分布，随染色时间的推延，“染色粒”由“染色小粒”聚集成“染色大粒”，逐渐由外缘向内缘推进至染色面中心（此过程需要20-30分钟以上），则表明细胞着色已完成，
●再用自来水缓流冲洗，使染色液沉渣及染色粒浮去，使其充分起分色作用，去除细胞染色中浮色，显示出胞核结构及细胞清晰形态，待干，镜检。
五．外周血细胞形态学检验技巧
（一）WBC形态学
（二）红细胞形态学
（三）出现有核（内/巨幼）红/幼粒细胞意义
（四）血小板巨核细胞
外周血中三种血细胞数与形态学表现：
○反映骨髓造血状态及血液病和其他疾病的厨窗；
○是检查与观察疾病的重要指标；
（一） WBC形态学诊断技巧：
1．WBC数值准确性估计：
（1）目前自动化计数仪时有出现结果的偏差，低倍镜观察血涂片可以粗略估计WBC数值及分布。低倍视野WBC数：正常约3～ 5个，增多6个以上，减低3个以下。
（2）WBC如推至片尾，分布不均，估计将有一定难度。较大的细胞如单核、异淋及中性粒细胞及不成熟细胞多在片尾，体部则多为较小的淋巴细胞，使分类造成偏差，所以分类部位在适当调整。
2． 白细胞计数值限度分级：
（1）WBC正常范围：4.0~10.0×109/L;
（2）WBC正常限度以下:
轻度减少(<4.0～3.0×109/L),
中度减少(<3.0～2.0×109/L),
极度减少(<2.0×109/L);
（3）WBC正常高限度以上:
分轻度增多(>10.0～20.0×109/L),
中度增多(>20.0～40.0×109/L),
明显增多(>40.0～80.0×109/L)
极度增多(>80.0×109/L)。
以此与所测知WBC计数值作粗略对比，推断WBC计数值的准确性。
（4）如在血片分类计数过程中发现较多有核红细胞时，
●计出血片中有核红所占%率，即以校正原WBC计数值减去有核红所占比例，求出外周血中WBC总数值，
● 另作WBC分类计100个过程中遇到多少有核红细胞，即有核红细胞 个/100个WBC，
●或作血片有核细胞分类计数（包括有核红细胞），计出有核红细胞所占%率。
3． WBC分类正常范围及其病理性改变：
（1）WBC分类正常范围：
新生儿出生后最初24小时白细胞数高，主要为中性粒细胞,至第3～4周，中性粒细胞与淋巴细胞比例倒转，直至4岁淋巴细胞比例仍多。见表一
表1 正常成人白细胞分类范围：
% 有 绝对值/ 109 L
中性粒细胞 40 ～ 75 2.8～7.5×109
淋巴细胞 20 ～ 50 1.5～3.5×109
单核细胞 2 ～ 10 0.2～0.8×109
嗜酸性粒细胞 1 ～ 6 0.04～0.4×109
嗜碱性粒细胞 <1 0.015～0.1×109
白细胞分类正常范围由于民族、地区、年龄、性别及其生理性变化的影响，以及检查本身的技术差异，即使一人同次取材不同涂片、一张涂片多次分类计数结果也不可能完全一致，但不可差异太大。见表二
表2 NCCLS对分类中的一些术语含量作了规定
术 语 %（相对值） 绝对值（109/L）
WBC增多：总数 - > 1 2.0
中性粒细胞增多(相对) > 7 5 > 9.0
嗜酸性粒细胞增多 > 7 > 0.5
嗜碱性粒细胞增多 > 2 > 0.15
单核细胞增多 > 10 > 0.85
淋巴细胞增多 > 47 > 3.2
WBC减少 - < 4.0
粒细胞减少 < 40 < 1.75
分类中占大比例的中性粒细胞或淋巴细胞呈正态分布，占小比例的嗜酸/嗜碱性粒细胞及单核细胞则为Poisson分布。
（2） 病理性形态学改变：
中性粒细胞
●中性粒细胞分叶分化程度，
○被认为从干细胞至粒细胞生成是否正常及与粒细胞年龄相关；如核分叶不良，Pelger-huet现象；
○核仅一叶或二叶，其百分率增加时谓之“左移”，反之，多数细胞四叶以上谓之右移，
○一般认为正常中性粒细胞胞核分叶情况：
--4叶者为 15～25% 3叶者为 40～50%
--2叶者为 20～40% 1叶者为 < 5%
-->5叶以上者提示有巨幼细胞性贫血的可能。
○右移现象：-多见于巨幼细胞性贫血、肝脏疾患，并可以5叶与4叶所占比例计算，得出简单实用的分叶指数：
分叶指数 =5叶/4叶 × 100% 正常核分叶指数：0～17%
-还见于缺铁性贫血、类风湿性关节炎、遗传性高分叶症（显性遗传）及某些败血症（以左移多见）。
○左移现象-见于感染、败血症、出血、小儿慢性中性粒细胞减少症等。
●中性粒细胞毒性颗粒及空泡改变：中性粒细胞由于受到外来刺激（包括感染及应激反应）引起颗粒变性，粗大着色深染及浆内空泡等病理性改变。上述改变及白细胞数增多和出现幼稚及原始细胞则为类白血病反应。
○慢性粒细胞白血病（CGL）的中性成熟粒细胞一般胞浆颗粒较正常稀少，但无空泡及毒性颗粒，而慢性中性粒细胞白血病（CNL）的中性成熟粒细胞则与类白血病反应形态相似。
○假性嗜酸性颗粒形态异常：类似嗜酸性样颗粒的出现。-在某些干细胞疾病如MDS、粒细胞缺乏症、肾性贫血某些患者中性粒细胞的颗粒增多
○遗传性白细胞异常疾病：是先天性白细胞异常疾病，临床上虽罕见，但为了提高辨别的能力，应有所认识。
○
Pelger-Huer白细胞异常：属于显性遗传，其白细胞形态特点：核分
叶不良，不分叶，核呈花生形、亚铃形等形状，无核丝形成，胞浆正常，此外，还有假性（即继发性）Pelger-huet白细胞异常应加以鉴别，后者常见于急性肠炎、伤寒、疟疾、流感，无家族史，但在原发病得到治疗后白细胞形态恢复正常。
○ Alder-Reilly颗粒异常：常染色体隐性遗传性多糖代谢障碍性疾病，常伴有软骨畸形、肝、脾肿大等，中性、嗜酸性及嗜碱性粒细胞含有多量嗜天青颗粒遮盖整个细胞，单核细胞亦有类似改变。
○ May-Hegglin异常：为常染色体显性遗传疾病，在中性及嗜酸性粒细胞浆内含有Dunle小体，常伴有巨血小板及血小板减少、紫癜，由于细胞的游走功能差，故病人常出现感染症状。继发性也可见于猩红热、球菌性感染、烧伤早期等某些病例。
●嗜酸性粒细胞：此种细胞在人体每日规律性变动，晨至午下降，午后始升，午夜至次晨3时达高峰数值，哮喘患者及夜间工作者其规律与正常相反，晨9至12时达高峰。
○临床上嗜酸性粒细胞增多见：
○过敏性疾病:如血管神经性水肿、哮喘、食物及药物过敏、血清 病、荨麻疹、枯燥热等。
○寄生虫病：常见于血丝虫、钩虫、包囊虫、肺吸虫、蛔虫、吕弗氏（Lofllers）综合征、蛲虫、旋毛虫、疟疾（偶见）及血吸虫等。
○皮肤病：如湿疹、剥脱性皮炎、天疱疮、牛皮癣、疟疾、疥、感染、猩红热早期等。
○血液病：高嗜酸性粒细胞综合症、CML、嗜酸性粒细胞白血病、何杰金氏病（占10%病例）、嗜酸性肉芽肿、家族性嗜酸性细胞增多症、热带嗜酸性细胞增多症、甲状腺癌及播散性结缔组织病。
○与化学药物有关：镍（致皮肤炎）、青霉素、PAS、苯、呋喃妥因、磺胺等。
●嗜碱性粒细胞：
○在正常人血液中为数甚少，该细胞嗜碱性颗粒含大量组织胺及肝素类物质，
○临床上主要因骨髓增殖性疾病常伴嗜碱性粒细胞增多如CGL、CGL嗜碱变、嗜碱性粒细胞白血病、M4EO、真性红细胞增多症、骨髓纤维化、何杰金淋巴瘤、、溶血性贫血、肿瘤等，
○还可见于感染恢复期、甲状腺功能低下肝硬化、结核病、流感、以及月经初潮等.
●淋巴细胞：
○淋巴细胞为免疫反应细胞，来源于骨髓淋巴干细胞，经胸腺素作用分化为T淋巴细胞，参与细胞免疫，另一类经骨髓而成为B淋巴细胞，产生免疫球蛋白，可作为体液免疫。
○外周血内淋巴细胞可分为大、中、小淋巴细胞，其形态一般不难辩认。
○在临床由于各种因素刺激出现异常淋巴细胞，常出现于病毒感染性疾病，如传染性单核细胞增多症、传染性淋巴细胞增多症，传染性肝炎、水痘、风疹、流感、结核病、药物过敏、慢性感染、放射病、应激状态及免疫异常等。
○异常淋巴细胞其胞体增大，比正常淋巴大一倍以上，核染色质疏松、增多，胞浆丰富或不规则、有很强嗜碱性呈深兰色、不均匀不透明或有泡沫或深兰色、周边着色加深，可见嗜天青红颗粒或空泡。
按Doney氏类型分三型：
Ⅰ型：最多见，胞体增大，核圆、卵圆或肾形，染色质疏松、粗糙，胞浆丰富、深染,有泡沫或空泡，偶有嗜天青颗粒，核/浆约1:1。
Ⅱ型：胞体较大，主要胞浆明显增多，且不规整（体如单核细胞），染色质较致密，不如Ⅰ型增多聚集，胞浆淡兰染，少数有嗜天青颗粒或少许空泡，核/浆为1:2。
Ⅲ型：少见，大致与Ⅰ型相似。可有核仁。
●此外,Tuck细胞即刺激细胞也是一种异常淋巴细胞,其意义与上述异常淋巴细胞相同。
●外周血中恶性淋巴细胞见于下列疾病：原幼淋巴细胞-见于ALL或CLL淋巴瘤。多发性骨髓瘤、淋-浆细胞-华氏巨球蛋白血症、毛细胞-毛细胞白血病。
●幼淋细胞（Prolympho Cytic Cell；PLC）属于幼淋细胞白血病（Prolymph Cytic Lenkemia；PLL）的病理性细胞，介于幼淋与成熟淋巴细胞之间的特殊幼淋细胞，具有成熟的核染色质与核仁并存的发育失衡的异相为最突出的特征。
●单核细胞：
是血中吞噬性细胞，参与免疫作用，在新生儿出生后一周内，在外周血中单核细胞可高至4.0×109/L ，平时由于采血部位及时间不同也有差异。临床上，单核细胞增多见于以下情况：
○常见于细菌感染、结核、细菌性心内膜炎、布氏杆菌病、菌痢或感染性疾病恢复期。
○寄生虫病：疟疾、锥虫病、黑热病、阿米巴肝脓肿等。
○恶性疾病：慢性单核细胞白血病、慢性粒-单核细胞白血病（CMML）、MDS及恶性肿瘤。
（二）红细胞形态学诊断技巧：
1．RBC/Hb、网织RBC、MCV、MCH、MCHC及RBC体积分布宽度（RDW）是判定贫血类型重要依据：
(1)Hb/RBC比值：正常人：Hb/RBC比值为3gHb/L=100万RBC/ μL即3:1。AA、溶血性贫血及继发性贫血等属此类。>3:1者即为大细胞高色素性贫血,<3:1者为小细胞低色素性贫血.
(2)网织RBC是新生的RBC，可反映造血机能的好坏：正常情况下为0.5~1.0%,代偿性反应者多>5%。其网织RBC内嗜碱性网织增多，代偿性功能减低者，低于正常水平。多见于AA，但有不典型AA（1/4）患者可有网织RBC增高。网织RBC计数1000个RBC中有多少网织RBC，以其%数表示，是一个比值数，不是绝对值。精确应计算绝对值或用流式细胞仪计数更为确切。
(3)MCV、MCH、MCHC反映RBC病理变化：可将贫血分为大细胞性贫血、正常细胞性贫血、小细胞低色素性贫血及单纯小细胞性贫血（即小细胞性正常色素性贫血），其诊断标准及其病因。
2．RBC形态学在检验中常被忽视，
(1)观察RBC形态一般以外周血涂片较为可靠。
(2)RBC形态与排列（如重叠、缗钱状）与涂片技术、涂片部位及厚薄有很大关系。这点在镜检时应予注意。
(3)即是合格涂片，RBC形态依然与涂片部位及厚薄等多种因素有关：
○如取涂片中心区域，RBC中心淡染，多 >1/3细胞面积大小;
○取自涂片薄处或尾部，RBC形态误给人以“球形”，失去双凹盘形，中心淡染消失，所谓类球形改变；
○取厚片或制片干燥过慢，RBC未摊开，收缩变形，甚至出现人工中心染色过淡等；
○取厚片RBC则重叠堆积，呈假“缗钱状”，不便查清形态；
○玻片不清洁，油脂过多或骨髓脂肪过多，制片干燥不快，RBC则会形成人工的中心淡染区或空白区。
