ADC 单抗药物的分子量、氨基酸序列、糖基化位点以...（一）
ADC 单抗药物的分子量、氨基酸序列、糖基化位点以及ADC 药物结合位点鉴定
1. 前言
单克隆抗体药物是具有高度特异性的靶向药物，能够特异性作用于肿瘤细胞，被誉为治疗恶性肿瘤的“生物导弹”。ADC 抗体药，则是在抗体蛋白的特定天然氨基酸上非定点偶联具有抗肿瘤作用的化疗药物（或称小分子药物），以增加单克隆抗体的疗效、并降低小分子药物的副反应。对此，研究人士表示，这相当于在“生物导弹”上精确地装上了“核弹头”，使得治疗更加安全、有效、定向。目前，在整个肿瘤药研究领域，ADC 抗体药物已得到了业内的普遍认可。不少跨国药企相继投身到 ADC 药物的研究开发中。为了保证 ADC 单抗药物的安全性和有效性，以及对单抗药物生产过程进行实时监控，对于 ADC 单抗药物的整体分子量的测定、氨基酸序列的鉴定、糖基化位点的确认、ADC 药物结合位点的确认、二硫键的定位、糖链结构的解析等重要的 ADC 药物分析指标的测试和确认，越来越受到各大制药公司的关注。目前，随着生物质谱技术的不断发展和推广，基于生物质谱的单抗分析技术也开始全面、快速的建立起来。
Q-Exactive 串联质谱仪结合了高选择性的四级杆质谱检测器和高分辨、高灵敏度的 OrbitrapTM 质量分析器，大大提高了离子的选择性、灵敏度和质量精度。该系统具有 140,000 的分辨率（FWHM）、更高的灵敏度、更快的扫描速度和更大的动态范围，同时结合了 HCD 碎裂技术，可以实现串级质谱碎裂和鉴定，为深度复杂样品分析，包括蛋白质组学、代谢组学、脂类组学等样品的鉴定，翻译后修饰和定量分析，提供了全面、高效和快速的质谱分析平台。同样，Q-Exactive 质谱可以有效地应用到 ADC 单抗药物的研发和生产监控中，基本的实验分析流程如下所示。
图 1. 单抗分析基本流程图
2. 实验部分
2.1 分子量测定
2.1.1 仪器和试剂
质谱仪器：Q-Exactive（赛默飞世尔科技，美国）；
色谱仪器：Accela 液相色谱系统（赛默飞世尔科技，美国）；
色谱柱：Agilent Zorbax 300, SB-C8, 3 μm，2.1×50 mm ；
试剂：二次去离子水，色谱级乙腈，色谱级甲酸。
2.1.2 仪器方法
色谱分析条件：具体见表 1；
质谱分析条件：具体见表 2；
表 1. 单抗分子量测定的色谱分析条件
流动相 | A：0.1% 甲酸水溶液；B：0.1% 甲酸乙腈溶液 | |
流速 | 300 μL/min | |
柱温 | 75℃ | |
色谱梯度 | 时间/min | B相浓度/% |
0 | 5 | |
4 | 5 | |
12 | 90 | |
12.1 | 90 | |
16 | 90 | |
16.5 | 5 | |
20 | 5 |
表 2. 单抗分子量测定的质谱分析条件
喷雾电压 | 4 kV |
毛细管加热温度 | 275℃ |
S-lens | 60 %; |
鞘气流速 | 30（arb） |
辅助气流速 | 5（arb） |
质量扫描范围 | m/z 2000–4000 |
分辨率 | 17,500（m/z 200） |
源内裂解（SID） | 100 eV |
Microscan | 10 |
