转化毕赤酵母
实验概要
本实验介绍了毕赤酵母的转化方法。
主要试剂
1. 转化当天,配制下列试剂:存于4度
5% SDS溶液
RD(Regeneration Dextrose) 融化琼脂100ml
2. 溶液:转化试剂
40%PEG:用水配制40%(w/v)PEG3350(试剂纯)
CaT:20mMTris pH7.5,20mM CaCl2
SOS:1M山梨醇,0.3×YPD,10mM CaCl2
3. 每次转化时配制:
SED:19mlSE 加1ml 1M DTT
PEG/CaT:1:1混合40%PEG及CaT
实验材料
GS115中,用SalI,StuI或SacI线性化的DNA可分离His Mut 重组子
KM71中,用SalI,StuI或SacI线性化的DNA可分离His Muts重组子
亲代载体用相同酶线性化
对照包括无DNA,线性化PBR322DNA及质粒(无细胞)涂板来检测是否有污染
实验步骤
1. 程序:
1) 将RDB平板放于室温,准备好融化的RD上层琼脂,取出线性化DNA置于冰上。
2) 取100ul去壁细胞到1.5 ml灭菌的有盖管中。
3) 取10ugDNA,室温孵育10min。
4) 同时配制PEG/CaT溶液,计算所需用量,加入等量的40%PEG/CaT(1:1)。
5) 加1ml新鲜的PEG/CaT溶液至细胞与DNA混合物中,轻轻混匀,室温孵育10min。
6) 室温750g离心10min,小心抽吸PEG/CaT溶液,颠倒管,轻叩管壁以排出多余的PEG/CaT溶液。
7) 用150ulSOS培养基悬浮转化细胞,室温孵育20min。
8) 加入850ul1M山梨醇,接下来涂板。
2. 涂板:毕赤酵母去壁细胞需要铺在顶层琼脂糖或琼脂上,以防止在选择前被裂解
1) 接第8步,取100-300ul去壁细胞-DNA,与10ml融化的RD琼脂糖混匀倒于RDB平板上,直至上层琼脂变硬。注意,确保有足够的去壁细胞-DNA铺第二板,第三板。
2) 倒置平板,28-30度孵育,转化子会在4-6天内出现。
3) 细胞活性:用100ul去壁细胞加入900ul 1M山梨醇。
4) 取稀释样本100ul,加入10ml融化的RDH,铺在RDHB平板上,等上层琼脂凝固。
5) 倒置平板,28-30度孵育,4-6天出现克隆,表明去壁细胞可再生成分裂细胞。