转基因植株的选择实验
实验材料 幼胚盾片
试剂、试剂盒 2 4-D AgNO3毒莠定特美汀草铵膦玉米素
仪器、耗材 诱导培养基再生培养基
实验步骤
1. 将可能含有转化细胞的幼胚盾片置于愈伤诱导培养基上培养产生愈伤组织，诱导培养基中添加 0.5 mg/L 2 , 4-D 和 10 mg /L AgNO3。对农杆菌处理过的培养物，培养基中还应加入 2 mg/L 毒莠定和 160 mg/L 特美汀，愈伤组织诱导培养在黑暗条件下进行，同时在这一阶段可加入选择剂 2~6 mg/L 草铵膦。
2. 3 或 4 周后将愈伤组织从诱导培养基转移至第一轮再生培养基，添加 0.1 mg/L 2 ,4 -D、25 mg/L CuSO4 和 5 mg/L 玉米素，并在持续的光照条件下培养。对农杆菌处理过的培养物，还要加入 160 mg/L 特美汀。可在这一阶段加入选择剂草铵膦 2~6 mg/L。
3. 3 或 4 周后评价再生/选择反应。再生的愈伤组织转移至添加了 5 mg/L 玉米素和 2~6 mg/L
选择剂草铵膦的第二轮再生培养基上继续培养 3~4
周。将一半非转基因对照的愈伤组织置于添加有选择剂的再生培养基上培养，另一半则在无选择剂的再生培养基上培养，分别作为选择对照和非选择对照。
4. 3 或 4 周后评价再生反应和选择反应。
5. 为确保降低非转基因细胞（或组织）的混入，只转移具有健壮绿芽或苗的部分至添加有 4~6 mg/L 草铵膦的再生培养基上，在 Magenta 培养盒（Sigma- Aldrich) 中继续培养 3~4 周。
6. 一旦再生苗长到 10~15 cm 长并有适当的根系时，就将这些可能的转基因植株移栽到含有特制土肥的 8 cm 塑料方盆中，并置于转基因封闭温室中生长。
实验材料 叶片
试剂、试剂盒 液氮DNA 纯化试剂盒bar 基因引物吐温PPT
仪器、耗材 PCR 分析塑料盆
实验步骤
一、PCR 分析
1. 当植株长到合适大小时（即 3 ~4 张叶片），取约 2 cm 长的叶片，立即放于液氮中，抽提基因组 DNA。
2. 在液氮中将叶片磨成粉末状，并使用 Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒提取基因组 DNA。
3. 为了确定是否为转基因植株，利用 bar 基因引物 1 和引物 2 对 DNA 做 PCR 分析，退火温度为 57℃。
4. 将 PCR 阳性植株移栽到直径为 13 cm 的塑料盆中，并继续在转基因封闭温室中生长。
二、除草剂叶片涂抹检测
1. 用 0.1% 吐温将除草剂母液（如 Challenge) 稀释成两种浓度，其活性成分 PPT 浓度分别为 2.0 g/L 和 0.2 g/L。
2. 每个待测植株，尽可能在不同分蘖上选择三张大小相近、生长健壮的叶片，避免取旗叶。立即在所选叶片植株的茎秆上做标记，分别标注为 0.2 g/L PPT、2.0 g/L PPT 和 对照（0.1% 吐温）处理。
3. 用圆珠笔在每张叶片长度一半的位置做标记用棉签蘸取适量溶液涂抹于叶片远端的半张叶片表面。
4. 为使除草剂生效，将植株放置 7 天后再评估抗/感情况。
5. 在涂抹了除草剂溶液的位置，根据除草剂溶液涂抹区域干枯伤害的百分率和除草剂转运对叶片近端区域伤害的百分率，对每张处理的叶片进行评分。
6. 如果 0.2 g/L PPT 和 2.0 g/L PPT 处理的叶片都没有检测到伤害症状，则可认为这一植株是转基因的；如果只在低浓度处理下表现出抗性，应当再用其他方法进行确认。
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