毕赤酵母原生质细胞的制作
实验概要
本实验介绍了毕赤酵母原生质细胞的制作方法，以备转化。
实验原理
毕赤酵母细胞壁阻止摄入DNA，有必要去除部分细胞壁以吸收DNA。藤黄节杆菌酶是一种葡聚糖酶，可在细胞壁水解葡聚糖的β－1，3接头，还可部分地消化细胞壁。该方法的关键在于不能过度消化细胞壁，否则会导致细胞死亡。藤黄节杆菌酶消化能力受细胞对SDS 敏感性的影响。等量细胞加入SDS，以产生原生质细胞，该步的结果是溶液变澄清，其澄清度可由800nm 处的吸光值获得。
一般经验，获得70%原生质细胞时，消化程度较好。用等渗溶液清洗细胞除去酶并与DNA 共孵育。将细胞重悬于山梨醇溶液中，细胞壁再生后再铺板。
主要试剂
1. 培养基：
YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose) 培养基1L
YPD 平板1L
RDB(Regeneration Dextrose Base)平板1L
RDHB(Regeneration Dextrose Histidine Base)平板1L
2. 溶液：细胞去壁试剂
1M 山梨醇
SE：1M 山梨醇，25mM EDTA pH8.0
DTT：用水配制成1M浓度
SCE： 1M 山梨醇，1mM EDTA ，10mM 柠檬酸钠缓冲液pH5.8
CaS：1M 山梨醇，10mMTris-HCl pH7.5，10mM CaCl2
藤黄节杆菌酶：用水配制成3mg/ml 的浓度
实验步骤
1. 程序：
1) 在YPD平板上划线培养GS115或KM71，28－30度培养2天，以得到分散的单克隆。
2) 在50ml离心管或100ml摇瓶中，从GS115或KM71平板上挑取单个克隆接种10mlYPD，28－30度剧烈振荡(250-300rpm)过夜。该培养基可在4度保存数天。
3) 在3个500ml培养瓶中加入200mlYPD，分别取5、10 及20ul 第2步中的细胞，于28-30度剧烈振荡(250-300rpm)过夜。
4) 第二天早上，将试剂盒中的转化溶液(SE，SCE，灭菌水，SOS，PEG，CaS，1M 山梨醇)，RDB平板(用于转化)、RDHB平板(活力对照)，放置于室温下。
5) 测每个培养瓶中的OD600值。
6) 收集OD600值为0.2-0.3瓶中的细胞，室温，1500g离心5-10min。去除上清，接下去准备细胞去壁。
注意：如果培养基都超过0.3，选择一个培养基，用新鲜培养基以1：4稀释，28-30度孵育直至OD600值至0.2-0.3(2-4小时)。收集细胞如第6步。
2. 准备细胞去壁：取得上述第6步细胞
1) 取100ml融化的RD琼脂糖，存于45度。
2) 解冻1管1M DTT。
3) 为该次去壁细胞试验准备新鲜的SED无菌条件下，将19mlSE转入合适的灭菌容器中(如50ml离心管)，加1ml 1M DTT混合均匀，为得到最好的效果，SED现配现用。
注意：DTT的质量及新鲜度是成功制备去壁细胞的关键，1M DTT分析纯，-20度保存。
3. 洗涤细胞：
1) 用20ml灭菌水悬浮洗涤细胞，转入灭菌的50ml的离心管中。
2) 室温1500g离心5min，收集细胞。
3) 将细胞重悬于20ml新鲜的SED中洗涤，如2离心。
4) 用20ml 1M山梨醇洗涤，离心如2。
5) 用20ml SCE缓冲液重悬细胞，将悬液分至两个50ml离心管中(10ml/管)。
6) 取1管藤黄节杆菌酶置于冰上，轻弹管壁以混匀，藤黄节杆菌酶以浆液的形式存在，无需配成溶液，将它混匀以确保每次的量是相等的。
4. 加入藤黄节杆菌酶：可先取一管细胞来确定用藤黄节杆菌酶消化细胞的最佳时间，一旦确定时间，取另一管细胞进行裂解。藤黄节杆菌酶消化细胞壁，使细胞变脆，拿样品时要轻柔些，加入藤黄节杆菌酶后，即开始消化细胞壁。
*准备至少20ml 5%SDS溶液
*将分光光度计调至800nm处，用800ul 5%SDS及200ul SCE作空白
*准备10个灭菌离心管，编号0，2，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，45，50
1) 取5步中一管细胞，取出200ul加入标0的管中，置于冰上，此即0点
2) 加7.5ul藤黄节杆菌酶到该管剩余细胞中，轻轻颠倒混匀，30度孵育，不要晃动样品。该样品可用于建立细胞去壁最佳时间表。将另一管细胞置于室温，用于第六步。将剩余藤黄节杆菌酶放于冰上。
3) 监测去壁细胞的形成：2min时，取200ul步骤2中的悬浮细胞，加入标2的管中。在t=4，5，6，，，50min时，重复上述操作，读样品OD800值。
4) 用公式确定每个时间点时去壁细胞的形成比例：
%去壁率=100-［(时间t时OD800值/时间0时OD800值)×100］
如 t=0时，OD800=0.256，t=15时，OD800=0.032
计算：%去壁率=100-［(0.032/0.256)×100］=100-［(0.125)×100］=100-12.5=87.5%
5) 确定去壁率为70%时的时间，藤黄节杆菌酶的用量不同，最佳时间也各不相同。Invitrogen实验室的最佳去壁时间为15-40min。
注意：确定获得所需量去壁细胞的最小时间很重要，藤黄节杆菌酶消化时间过长，对细胞有害，效率会降低。
6) 在另一管中加入7.5ul藤黄节杆菌酶(如步骤1)，将管放于30度，时间为步骤5中建立的最佳时间，以获得最佳比例70%的去壁细胞。
7) 室温750g离心10min，收集去壁细胞，去除悬浮液。
8) 用1M山梨醇洗去壁细胞1次(轻叩管壁以分散去壁细胞团，不要涡旋)。如上离心。
9) 用10ml CaS洗涤去壁细胞，如7中离心，用0.6mlCaS重悬细胞。去壁细胞必须立即(至多30min)用于转化。不能放更长时间，这些细胞共可作6次转化。
