聚合酶链反应构建重组DNA
基本方案
| 实验方法原理 | 利用聚合酶链式反应（PCR），任何两个DNA片段可连接成一个新的重组DNA分子。通过在PCR引物中引入的额外非同源的核苷酸，可在连接处产生所需要的读码框架或酶切位点。 |
|---|---|
| 实验材料 | DNA |
| 试剂、试剂盒 | TE 无水乙醇 DNA聚合酶 CTP |
| 仪器、耗材 | 电泳仪 离心机 PCR仪 |
| 实验步骤 |
1. 制备模板DNA，如DNA不是经氯化铯梯度纯化的，100℃煮沸10 min 以灭活核酸酶。
2. 制备寡核苷酸引物，若PCR产物要进行平端克隆，就应该对引物的5'端羟基进行磷酸化处理。
3. 建立标准的扩增反应，以矿物油覆盖表面，在以下条件下进行20~25轮扩增循环：94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸3 min，最后一个循环在72℃延伸10 min 尽可能使扩增产物完整。
4. 取少量反应混合物（4~8 ul），用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增效果。
5. 吸去矿物油上层，用氯仿抽提1次除去残存的矿物油，用饱和酚抽提1次，然后用无水乙醇沉淀DNA。
6. 4℃高速离心10 min，沉淀用20 ul TE缓冲液溶解。
8. 对于通过平端连接进行的克隆：用DNA聚合酶I （或klenow酶）修平扩增片段的3'末端。
9. 对于通过粘端连接进行的克隆：在20 ul 体积用合适的酶消化一半PCR只产物，用过量的酶消化数小时。
10. 用合适的末端互补的酶在20 ul 体积内消化0.2~2 ug 载体DNA，用CIP去瞵酸化，以阻止载体自连。
14. 取部分连接产物转化大杨杆菌，从转化体集中以小量制备法提取质粒DNA。
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| 注意事项 |
1. 如果出现非特异性带，则可能： （1）引物设计不合理，出现发夹结构或二聚体； （2）退火温度不合适； （3）聚合酶质量不好； （4）有污染； （5）引物不纯或过量； （6）模板过量。
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| 其他 |
随着科学技术的不断发展，在传统PCR技术的基础上发展了包括逆转录PCR，实时定量PCR等新技术，以及多重PCR、DNAshuffing，PCR芯片，固相PCR等改良技术。目前有运用恒温快速扩增技术作为DNA甲基化特异性检测方法来验证癌症的基因，为医学领域的深入探究提供新方法新思路。
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