多酶恒温核酸快速扩增技术MIRPA的引物与探针设计指导
近期,顶级学术期刊连发两篇顶级论文，上半年引爆生物圈的华人科学家张锋教授团队又有新动作!这次,他在一月内,分别在《Nature》、《Science》连发两篇论文!他将CRISPR-Cas13a改造成了灵敏度达到了阿摩尔级(aM,10的负18次方摩尔每升),可以检测单分子的SHERLOCK技术。而这其中,RPA起到了不小的作用。
RPA,即重组酶聚合酶扩增技术,是在由多种酶和蛋白的参与下,在恒温条件下实现核酸指数扩增的技术,被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。是英国TwistDx公司开发的，该公司通过突破等温DNA扩增，开发的重组酶聚合酶扩增ZL技术（RPA），被誉为DNA诊断领域的革命性创新。
安普未来生物科技有限公司经过十年技术沉淀，以代表未来技术趋势的多酶恒温快速扩增技术，MIRA（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA）。
MIRA（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA）技术是一种多酶恒温核酸快速扩增技术，
基本原理是：在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体 Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白 SSB 的帮助下，侵入双链 DNA 模板；在侵入位点形成 D-loop 区域，并开始对 DNA 双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体 Rec/ssDNA 解体的同时，聚合酶也结合到引物的 3’末端，开始链的延伸，这个过程迅速高效地循环，从而完成目的片段超快速扩增。
荧光检测则依赖核酸外切酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用荧光监测设备实现对目标片段扩增过程的实时监控。
图 1：MIRA 技术原理图示
★引物设计
建议使用长度在 30-35bp 的引物，引物过长或过短会影响扩增速度和检测灵敏度（特殊情况下设计较长
引物比较困难的序列，引物长度可缩短至 25 bp，但最好不少于 25 bp）；引物序列要求：
1.碱基排布随机性高，GC 含量在 30%-70%之间；
2.扩增片段避免形成二级结构而影响扩增；
3.扩增片段长度建议在 150-300 bp，通常不超过 500 bp。
★荧光探针设计
在上下游引物中间，设计一段长度为 46-52nt 与目的片段互补的序列作为荧光探针；探针序列不与特异
性引物识别位点重叠，长度为 46-52 nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。探针共有四
个修饰位点：
1.距离 5’端的 30-35 nt 的中部位置标记一个 dSpacer（四氢呋喃，THF），作为核酸外切酶的识别位点 （任
何碱基，无特殊要求） ；
2.THF 位点的上游的 T 碱基上标记一个荧光基团（如 FAM），下游在 T 碱基上标记一个淬灭基团（如
BHQ1），两个基团的间距为 2-4 nt；
3.THF 距离 3’末端约 15 nt，并且 3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或 C3-spacer。
图 2：MIRA 荧光探针图示
4.探针示例：
探针序列：
5’-ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAGTAGCTCTCAAAGATGGACC-3’
30-35nt ≥15nt
探针修饰：
ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAG[FAM-dT]AG[THF][BHQ-dT]CTCAAAGATGGACC-3’C3spacer。
