维生素C测定：硝基苯肼法
1．原理总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸。样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4-二硝基苯肼作用生成红色脎，脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。
2．适用范围GB12392-90本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。
3.仪器3.1恒温箱：37±0.5℃3.2可见-紫外分光光度计3.3打碎机
4．试剂本实验用水均为蒸馏水，试剂纯度均为分析纯。4.14.5mol/L硫酸：谨慎地加250ml硫酸（比重1.84）于700ml水中，冷却后用水稀释至1000ml。4.285%硫酸：谨慎地加900ml硫酸（比重1.84）于100ml水中。4.32%2，4-二硝基苯肼溶液：溶解2g2，4-二硝基苯肼于100ml4.5mol/L硫酸内，过滤。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。4.42%草酸溶液：溶解20g草酸于700ml水中，稀释至1000ml。4.51%草酸溶液：稀释500ml2%草酸溶液到1000ml。4.61%硫脲溶液：溶解5g硫脲于500ml1%草酸溶液中。4.72%硫脲溶液：溶解10g硫脲于500ml1%草酸溶液中。4.81mol/L盐酸：取100ml盐酸，加入水中，并稀释至1200ml。4.9活性炭：将100g活性炭加到750ml1mol/L盐酸中，回流1~2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子（Fe3+）为止，然后置于110℃烘箱中烘干。4.10标准（1）抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）：溶解100mg纯抗坏血酸于100ml1%草酸溶液中。（2）标准曲线绘制加1g活性炭于50ml标准溶液中，摇动1min，过滤。取10ml滤液放入500ml容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度。抗坏血酸浓度为20μg/ml。取5，10，20，25，40，50，60ml稀释液，分别放入7个100ml容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1，2，4，5，8，10及12μg/ml。按样品测定步骤形成脎并比色。以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度（μg/ml）为横坐标绘制标准曲线。
5.操作步骤5.1样品制备全部实验过程应避光。5.1.1鲜样制备：称100g鲜样和100g2%草酸溶液，倒入打碎机中打成匀浆，取10-40g匀浆（含1-2mg抗坏血酸）倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。5.1.2干样制备：称1-4g干样（含1-2mg抗坏血酸）放入乳钵内，加入1%草酸溶液磨成匀浆，倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。5.1.3将上述两液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。5.2氧化处理：取25ml上述滤液，加入0.5g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10ml此氧化提取液，加入10ml2%硫脲溶液，混匀。5.3呈色反应5.3.1于三个试管中各加入4ml稀释液。一个试管作为空白，在其余试管中加入1.0ml2%2，4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放入37±0.5℃恒温箱或水浴中，保温3h。5.3.23h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后加入1.0ml2%2，4-二硝基苯肼溶液，在室温中放置10~15min后放入冰水内。其余步骤同样品。5.3.385%硫酸处理：当试管放入冰水后，向每一试管中加入5ml85%硫酸，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。5.3.4比色：用1cm比色杯，以空白液调零点，于500nm波长测吸光值。
6.计算同荧光法。
7.注意事项
7.1大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用2%草酸溶液制成匀浆以保存维生素C。
7.2若溶液中含有糖，硫酸加得太快，溶解热会使溶液变黑。
7.3试管自冰水中取出后，颜色会继续变深，所以，加入硫酸后30分钟应准时比色。
