2，4-二硝基苯肼比色法测定水溶性维生素
1、原理
总维生素C包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸。用酸处理过的活性炭把还原型维生素C氧化为脱氢维生素C,再继续氧化为二古乐糖酸,二古乐糖酸再与2,4-二硝基苯肼作用生成红色脎,根据脎在硫酸溶液中的含量与维生素C含量成正比,进行比色定量。
2、仪器
①恒温箱:37℃士0.5℃。
②可见-紫外分光光度计。
③碎机
3、试剂
①硫酸(4.5mol/L) 小心地加250mL浓硫酸(相对密度1.84)于700mL水中,冷却后用水稀释至1000mL。
②85%硫酸 小心地加900mL浓硫酸(相对密度1.84)于100mL水中。
③2,4-二硝基苯肼溶液(20g/L) 溶解2g2,4-二硝基苯肼于100mL硫酸(4.5mol/L)中,过滤。不用时保存于冰箱中,每次用前必须过滤。
④草酸溶液(20g/L) 溶解20g草酸(H2C2O4)于700mL水中,稀释至1000mL。
⑤草酸溶液(10g/L) 取500mL草酸溶液(20g/L)稀释至10mL。
⑥硫脲溶液(10g/L) 溶解5g硫脲于500mL草酸溶液(10g/L)中。
⑦硫脲溶液(20g/L) 溶解10g硫脲于500mL草酸溶液(10g/L)中。
⑧盐酸(1mol/L) 取100mL盐酸,加入水中,并稀释至1200mL。
⑨维生素C标准溶液 称取100mg纯维生素C溶解于100mL草酸溶液(20g/L)中,此溶液每毫升相当于1mg维生素C。
⑩活性炭 将100g活性炭加到750mL盐酸(lmol/L)中,回流1～2h,过滤,用水洗数次,至滤液中无铁离子(Fe3+)为止,然后置于110℃烘箱中烘干。
检验铁离子的方法:利用普鲁士蓝反应,将亚铁氰化钾(20g/L)与1%盐酸等量混合,将上述洗出滤液滴入,如有铁离子则产生蓝色沉淀。
4、操作方法
1)试样的制备
①鲜样的制备 称取100g鲜样及吸取100mL20g/L草酸溶液,倒人捣碎机中打成匀浆,取10～40g匀浆(含1～2mg维生素C)倒入100mL容量瓶中,用草酸溶液(10g/L)稀释至刻度,混匀。
②干样制备 称1～4g干样(含1～2mg维生素C)放入乳体内,加人草酸溶液(10g/L)磨成匀浆,倒入100mL容量瓶中用草酸溶液(10g/L)稀释至刻度,混匀。
将上述试样过滤,滤液备用。不易过滤的试样可用离心机离心后,倾出上清液,过滤,备用。
2)氧化处理
取25mL上述滤液,加入2g活性炭,振摇1min,过滤,弃去最初数毫升滤液。取10mL此氧化提取液,加入10mL硫脲溶液(20g/L),混匀,此试样为稀释液。
3)显色反应
①于三个试管中各加入4mL氧化处理的稀释液,一个试管作为空白,在其余试管中加入1.0mL2,4-二硝基苯肼溶液(20g/L),将所有试管放入(37士0.5)℃恒温箱或水浴中保温3h。
②3h后取出,除空白管外,将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷却至室温,然后加入1.0mL2,4-二硝基苯肼溶液(20g/L),在室温中放置10～15min后放入冰水内。其余步骤同试样。
4)85%硫酸处理
当试管放入冰水后,向每一试管中加入5mL85%硫酸,滴加时间至少需要1min,需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出・在室温下放置30min后比色。
5)比色
用1cm比色皿,以空白液调零点,于500nm波长测吸光值。
6)标准曲线的绘制
①加2g活性炭于50mL标准溶液中,振摇1mim,过滤。
②取10mL滤液放入500mL容量瓶中,加5.0g硫脲,用草酸溶液(10g/L)稀释至刻度,维生素C浓度20g/mL。
③取5mL、10mL、20mL、25mL、40mL、50mL、60mL稀释液,分别放入7个100mL容量瓶中,用硫脲溶液(10g/L)稀释至刻度,使最后稀释液中维生素C的浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL。
④按试样测定步骤形成脎,并比色。
⑤以吸光值为纵坐标,维生素C浓度(μg/mL)为横坐标,绘制标准曲线或求得回归方程。
5、计算
式中 X——试样中总维生素C的含量,mg/100g;
c——由标准曲线查得或由回归方程算得的试样氧化液中总维生素C的浓度, μg/mL;
V——试样用10g/L草酸溶液定容的体积,mL;
F——试样氧化处理过程中的稀释倍数;
m——试样的质量,g。
计算结果表示到小数点后两位。
6、说明及注意事项
①本方法为GB/T5009.86-2003标准第二法,第一法为荧光法。此外还有2,6-二氯靛酚滴定法、高效液相色谱法等。
②全部实验过程应避光进行操作。
③加入85%硫酸后试管从冰水中取出,溶液的颜色会继续变深,所以必须计算好,加入硫酸后准时0.5h比色。
④硫脲可防止维生素C被氧化,且可帮助脎的形成,最终溶液中硫脲的浓度均需一致,否则影响色度。
