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xCELLigence 系统内源性GPCRs 细胞功能研究（二）

2020.7.13

材料与方法
    细胞系与培养条件：细胞系来自于ATCC。按照 ATCC 的建议进行HeLa（#CCL-2）、U2OS （#HTB-96）、SH-SY5Y（#CRL-2266）、CHO-K1 （#CCL-61）、人血管内皮细胞（HUVEC；# PCS-100-010 批号 58570370）与混合肾原代上皮细胞（MREC；ATCC # PCS-400-012 lot # 58488854）的培养，肿瘤细胞系传代至 10 代以上，原代细胞系传代至 4 代。
    检测程序：所有检测均于组织培养器（5% CO2，37°C ）中进行。细胞培养基为生长培养基，细胞接种密度是 1-2 x 104 细胞每孔，接种于96孔E-Plates 中，并通过xCELLigence 系统进行过夜监测，直至细胞生长至接近满板，复孔检测。预先在另一普通96孔板中每孔中添加 2 µl 药物，并储存于 -20℃。待细胞培养 18-24 小时后，进行药物稀释反应。将药物融解，并添加 132 µl 检测缓冲液（1 x HBSS，Sigma H8264、20mM HEPES，Cellgro 25-060-Cl、0.1% BSA，Fisher Scientific #BP1600）对其进行稀释处理。从培养箱中移除 E-Plates 96，使用检测缓冲液进行洗涤，洗涤一次，并使用Biotek MicroFlo Select，于每孔中添加 140 µl 检测缓冲液。将 E-Plates 96 放回至RTCA MP 站，放置15 分钟，进行细胞平衡。然后使用 Beckman Multimek 96，同时在各孔添加10 µl的药物缓冲液。小分子药物实验最终浓度为10 µM，多肽为1 µM。
    数据分析：使用 RTCA 软件，对每孔的数据在药物添加前时间点进行标准化处理。对于各种药物，在计算时需减去只含药物溶剂时对照细胞表现出的背景值。小分子药物相应溶剂为DMSO，多肽药物相应溶剂为0.1% 的BSA 。
    将检测结果数据导出至Microsoft Excel，进行后续计算。确定每孔细胞的最大与最小细胞指数值，计算重复检测（n=2）的均值标准差与平均值。对于对照孔细胞来说，对重复检测 8 个孔的均值标准差进行测定。将这些数值平均并乘以 3 以计算“hit”阈值。对于 Z 因子与 EC50 计算来说，使用RTCA MP提供的动态反应曲线，选择一时间点作为细胞系及药物综合反应的最佳时间点。

结果
    为确保研究的重现性，细胞为可靠来源，并可确保细胞的质量与类别。所有实验细胞均来自于美国细胞菌种库（ATCC）。检测前，进行有限传代，按照 ATCC 的建议进行细胞的保存。
内源性GPCR检测稳定性。检测各种条件下HeLa细胞对内源性GPCRs激活剂的反应性。且将钙离子载体 A23187作为阳性对照，并对其进行检测。低浓度情况下，由于 Gq-偶联 GPCR 的激活，A23187可模拟钙离子的活化过程。由于其独立于GPCRs的表达，这种反应有助于细胞检测条件的研发。最强烈反应出现于过夜长满平板的细胞。此时使用 GPCR 检测通用缓冲液更换掉生长培养基（参见详细检测条件中的材料与方法）。
    按照这些检测条件对几种不同细胞系对 A23187 与1-磷酸鞘氨醇（SIP）的反应进行评价，SIP 是无所不在的 GPCR 表达家族、溶血磷脂或内皮分化基因（EDG）受体的内源性激活剂。Z量测因子考虑有信噪比与检测的变异性，用于对检测强度进行评价(3)。使用终浓度 1 µM 或与缓冲试剂（0.1% BSA）相同浓度的 S1P 与终浓度 100 nM 或与其缓冲试剂（DMSO）相同浓度的 A23187 对 8 个重复多孔培养的细胞进行处理。使用xCELLigence 系统，对细胞反应进行实时监测，间隔时间1分钟。
    激活剂添加后最初几分钟期间，即开始检测细胞反应。每种细胞系中，添加激活剂后的最初 30-40 分钟期间细胞反应最大（参见图 1）。如图所示，处理后接近 30 分钟时，HeLa 细胞对A23187 的反应最大，对S1P 的反应接近最大。此时，A23187 与 S1P 的 Z 因子分别是0.83与 0.90。所检测的细胞类型中，两种处理中至少一种 Z 因子分值超出0.5，表明检测可靠性高（参见表 2）。相反，两种配体混合的原代肾上皮细胞（RMEC） Z 因子接近 0.25，表明检测可靠性不显著。但后续 GPCR 筛查检测结果表明，该细胞类型其他 GPCRs 可靠性更高。

图 1：GPCR 检测可靠性评价。HeLa 细胞接种密度是 10000 细胞每孔，接种于E-Plate 96 上，放置于xCELLigence RTCA MP 仪器，并在培养箱中过夜。然后去除生长培养基，添加检测缓冲液，持续细胞监测 15 分钟后，添加 GPCR调节药物，记录每分钟细胞反应情况，记录 1.5 小时。获得时间依赖性细胞反应曲线。八复孔，误差列代表均值标准差。药物添加后 30 分钟，计算单一时间点 Z 因子值检测质量。DMSO 是 A23187 试剂对照；0.1% BSA 用于 S1P。SD = 标准差；ABS = 绝对值。

图 2：GPCR 检测灵敏性评价。如图 1 方法，对 HeLa 细胞进行检测，每种药物以8个浓度处理细胞。使用 RTCA 软件，通过计算药物添加30分钟后每种药物的EC50值，对检测灵敏性进行测定。

内源性GPCR检测灵敏性。我们也使用 A23187 与 S1P，以及 8 点剂量反应曲线检测实验灵敏性（参见图 2）。于 Z 因子测定相同时间点，通过 RTCA 软件计算产生 50% 最大反应（EC50 值）的激活剂浓度。
每种细胞系的 EC50 值见表 2。每种细胞对 A23187 的处理均比较敏感，除CHO-K1外，所有细胞类型对 S1P 的处理均非常敏感，产生的 EC50 值低限为 10-7 至 10-9。尽管 CHO-K1 细胞表达EDG 受体(4)，后续检测S1P 与溶血磷脂酸（LPA）反应分值为阳性（见下文），但是为生成准确的 EC50，很明显，这里所用的剂量不足以饱和生物反应。