lncRNA功能机制研究（二）
实验路线
（1）LINC00346调控胃癌发展的上游机制
结果：转录因子KLF5和MYC可与LINC00346启动子结合，并增强其表达
a. 转录因子MYC、KLF5和 LINC00346的Oncoprint分析；b. 在含有或未含有胃癌KLF5/ MYC / LINC00346 SCNAs的转录因子KLF5、MYC、LINC00346基因表达；c. GSE51705数据库的分析显示，KATO-III GC细胞中KLF5与LINC00346基因启动子结合；d. UCSC基因组生物信息学网站显示， MYC高度富集在LINC00346的启动子上；e. GSE51575数据库显示LINC00346的表达与KLF5或MYC正相关；f. qPCR显示LINC00346的表达与KLF5或MYC 正相关；g. ChIP实验显示，内源性MYC和KLF5与LINC00346基因启动子区结合。h. WB显示干扰或过表达LINC00346后，KLF5和MYC蛋白表达情况；i. 双荧光报告实验检测LINC00346启动子片段与KLF5或MYC直接结合
（2）LINC00346调控胃癌发展的下游机制
结果1：GSEA和GO分析LINC00346高/低表达胃癌患者和细胞
a. GSEA分析GSE65801数据中比较LINC00346高/低后差异基因的富集信号通路； b. 热图显示胃癌中过表达LINC00346后的差异基因；c. GO分析差异基因的富集情况；d,e. qPCR和WB筛选肿瘤相关的差异基因。
结果2：LINC00346通过调节Notch1、CD44和AXL促进胃癌细胞增殖和侵袭
a.IHC分析肿瘤组织和肿瘤肺转移组织中Notch1, CD44, 和AXL的表达；b. qPCR检测胃癌发生或未发生淋巴结转移组织中Notch1, CD44, 和AXL的表达；c. IHC检测胃癌发生或未发生淋巴结转移组织中Notch1, CD44, 和AXL的表达；d. WB检测胃癌细胞中Notch1, CD44, 和AXL的蛋白表达；e,f. Transwell实验检测Notch1, CD44 或 AXL对LINC00346侵袭功能的挽救能力；g. MTT和h.克隆形成实验检测Notch1, CD44 或 AXL对INC00346增殖功能的挽救能力。
结果3：LINC00346通过与miR-34a-5p相互作用调控Notch1、CD44和AXL
a. LINC00346和miRNA结合位点的预测；b. MS2-RIP实验验证LINC00346能够拉下的miRNAs；c. pull-down实验验证LINC00346吸附的miRNAs；d. 双荧光报告基因实验miR-34a与LINC00346直接结合；e. AGO2 RIP实验验证miR-34a能够拉下LINC00346；f. WB显示miR-34a能够挽救LINC00346对Notch1, CD44 或 AXL的蛋白水平的调节；g. Tranwell实验显示miR-34a能够挽救LINC00346对胃癌细胞迁移和侵袭能力的调节；h. 双荧光报告基因实验显示miRNA能与Notch1, CD44 或 AXL基因的3‘UTR直接结合； i. 原位杂交实验显示LINC00346和miR-34a能够共定位在细胞质中。
总结
本研究通过生物信息学分析、功能实验和分子机制探究实验技术揭示了胃癌发展中一个潜在的新机制：在胃癌的发展过程中，转录因子KLF5和MYC结合LINC00346启动子区，并促进其表达；在胃癌中高表达的LINC00346主要定位在胞质中，并竞争性吸附miR-34a-5p，抑制miR-34a-5p对其下游靶基因（Notch1, AXL, 和CD44）的调控，最终导致了胃癌的恶化发展。LINC00346对胃癌细胞的促增殖和转移的多效性作用提示LINC00346可作为胃癌的有效治疗靶点。
