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人细胞毒素相关蛋白A （CagA）检测试剂盒使用说明

2020.6.29

实验原理
此试剂盒基于酶联免疫法，采用HRP酶联物；第一次孵育中，样本中的抗CagA IgG 抗体与包被的CagA 抗原结合，洗板除去未结合的，再次孵育，二抗（过氧化物酶标记的抗人IgG）与CagA-抗原-抗体复合物结合，再次洗板后，无色的显色剂（TMB）底物液加入微孔内，与过氧化物酶反应生成了有颜色的复合物，加入硫酸终止颜色反应，酶标仪450nm和405nm处检测颜色强度，标准品和样本中的抗CagA IgG 抗体浓度与颜色强度成正比

试剂盒组成
足够用于96人份的试剂
试剂盒贮存于2-8℃
各试剂有效期见试剂瓶标签
试剂盒一旦开封，在2-8℃下可保存2个月

1. 【MTP】包被板，96孔，包被有CagA抗原（重组DNA获得），未用的板条保存于密封袋内2-8℃下

2. 【CAL】标准品，6瓶，1.5ml/瓶，抗CagA IgG 血清基质，浓度为0;15;30;60;120;240 RU/ml，即用，红色，叠氮化钠（＜0.1%）作为防腐剂

3. 【CONJ】酶联物，1瓶，14ml，HRPO标记的小鼠单抗抗人IgG，TRIS 缓冲液，稳定剂，即用，粉色，新霉素作为防腐剂

4. 【WASH】洗涤缓冲液（浓缩），1瓶，50ml，PBS-吐温20 ，硫柳汞（＜0.05%）作为防腐剂，使用前，用蒸馏水1:20比例稀释；若出现不溶解的晶体，则需在37℃下温育数分钟；稀释的洗涤液可在2-8℃下保存30天

5. 【DIL】样本稀释液（浓缩，）1瓶，20ml，血清基质，稳定剂，红色，叠氮化钠（＜0.1%）作为防腐剂，使用前以稀释的洗涤液1:20比例稀释；稀释的样本稀释液2-8℃下可保存30天

6. 【TMB】显色剂，2瓶，15ml，含柠檬酸-磷酸缓冲液，DMSO和H₂O₂的TMB，即用

7. 【STOP】封闭液，1瓶，14ml，1N的硫酸，即用

8. 【CPA】盖板

9. 塑料包装袋

实验所需材料但试剂盒未提供

1. 带一次性枪头的可调的，自动的微量移液器

2. 干燥箱，调节至37±2℃

3. 用于试剂稀释的刻度容器

4. 抽吸式泵或自动洗板设备

5. 酶标仪（450nm和405nm）

6. 坐标纸

7. 蒸馏水

此实验还可以用自动酶标仪进行操作

样本采集与准备
试验可检测血清或血浆样本
适量的脂血样本不会影响结果，高含量的脂血或溶血样本可能会影响试验，纤维蛋白丝会干扰试验；确保检测前样本是清澈的，样本在2-8℃下可保存1周，想要保存更长时间建议冻存于-20℃，避免反复冻融
使用前：以1:300的比例用先前已稀释的样本稀释液进行样本稀释
（如：10 ul 样本+ 2990 ul的稀释液）

实验步骤
试剂和样本平衡至室温
使用前来回倒置混匀样本

1. 准备的微孔：空白，标准品和样本

2. 加100 ul 的标准品和先前稀释的样本于相应的微孔内

注意：标准品不用稀释

1. 空白孔内加100 ul 的样本稀释液

2. 用试剂盒内提供的胶粘纸张盖住包被板，37±2℃下孵育60±5 min

3. 350 ul的稀释的洗涤液，洗板4次，吸走微孔内的所有液体

4. 每孔加100 ul的酶联物

5. 用试剂盒内提供的胶粘纸张盖住包被板，37±2℃下孵育30±2 min

6. 按照步骤5）洗板

7. 每孔加100 ul的显色剂

8. 37±2℃下孵育15 min，避免直射阳光

9. 每孔加100 ul的封闭液

10. 采用合适的酶标仪在50nm处读取吸收值，参考波长620nm（以空白对照孔校零），万一出现了吸收值溢出，则选择在405nm处读数；试验操作结束15min内必须完成读数

（若采用的是自动酶标板设备，依据相关手册操作）

实验操作图

包被孔	空白	标准品	样本
试剂
标准品	-	100 ul	-
稀释的样本	-	-	100 ul
样本稀释液	100 ul	-	-
孵育：37±2 ℃，60±5 min
洗板：4 x 350 ul
酶联物	100 ul	100 ul	100 ul
孵育：37±2 ℃，30±2 min
洗板：4 x 350 ul
显色剂	100 ul	100 ul	100 ul
孵育：37℃，15 min
封闭液	100 ul	100 ul	100 ul
读数：450 nm

结果计算
线性坐标纸上以标准品的浓度为X轴，吸收值为Y轴，绘制标准曲线；相应的抗-CagA IgG抗体浓度（RU/mL）根据各样本吸收值从标准曲线获得

1. 样本IgG 值小于10 RU/mL，则判定为抗CagA IgG 抗体无反应

2. 样本IgG 值10 -15 RU/mL，则判定为弱反应

3. 样本IgG 值高于15 RU/mL，则判定为抗CagA IgG 抗体有反应

计算示例
以下数值仅供演示示例，不能用于代替实验数值，通过标准曲线得到样本抗CagA IgG 抗体滴度为70 RU/mL。

验证标准
结果计算之前，先确保质控吸收值在以下期望值范围内

描述	期望值
阴性质控	＜0.100
OD 值之比（标准品240 RU/mL/标准品15 RU/mL）	＞2.5
OD 值之比（标准品15 RU/mL/标准品0 RU/mL）	＞3.5

若数值不在期望值范围内，需重新实验

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周锦帆