血清学筛选克隆新抗原/新基因（二）
19. 第一轮筛选得到阳性克隆需要进行第二轮筛选以去除假阳性并获得阳性单克隆噬菌体。过程如第一轮筛选，只不过用直径90mm 平板；具体过程见步骤4，这时所加入的噬菌体溶液是第一轮筛选得到的噬菌体上清（见步骤18），在用前要滴定好噬菌体的滴度，噬菌斑的数量以可区分出单个克隆，同时密度不能太稀为标准（一般100-200 pfu/90mm）。
20. 按第一轮相似的过程进行实验，最后显色，确定真正的阳性克隆，并将阳性单克隆所在的培养基挖出放入500μl SM buffer 中，并加入25 ml chloroform，4℃贮存（最多可贮存6 月）。
注意：
封闭液一般可用：5%的脱脂牛奶或1%的BSA 溶解在TBST 溶液中。
第一轮筛选用150mm 的平板；第二轮筛选用90mm 的平板，一般需要筛选至少1 x 106 pfu。
认真做好三个不对称的标记，特别在第二轮挑选阳性克隆时要仔细将膜与平板吻合好，不能挑错。
三、单克隆剪切
1. 取第二轮筛选得到的阳性克隆贮存液上清。
2. 将过夜培养的XL1-blue MRF’细菌2000 转/分离心10 分钟，将细菌溶解在10mM MgSO4 中，调整细菌溶度到OD600=1.0。
3. 在一个EP 管中加入：200μl XL1-blue MRF’细菌+250ul phage stock（步骤1）+1 ul ExAssist helper phage。
4. 将以上三种样品混合，37℃下共同保温15 分钟。
5. 将样品混合物加入到3 ml LB 培养基中，37℃震荡培养3-4 小时。
6. 将试管放于65-70℃水浴20 分钟，3000 转/分，离心15 分钟。
7. 将上清转入新的离心管中，已发生剪切的phage particles 在上清中（上清可在4℃下储存1-2 月）。
8. 将100ul phage 上清+200ul SOLR cells（OD600=1.0）混合，37℃保温15 分钟。
9. 取步骤8 中溶液5-10 ul 涂于LB-amp agar plates（amp=50ug/ml），过夜培养。
10. 第二天细菌长出，随机挑取单克隆接种到LB-amp 培养基中培养过夜。
11. 过夜培养细菌分为三部分：（1）提取质粒做双酶切，鉴定外源基因的大小；（2）送样品进行DNA 测序（3）加入30-40%的甘油进行保种，分装成小份储存于-80℃备用。
附录：
1、SM buffer(1L)：(5.8 g NaCl+2.0 g ma gnesium sulfate+50 ml 1M Tris (pH=7,5)+0.1 g gelatin)
2、AP-buffer：(100 mM Tris HCI (pH 9.5) ; 100 mM NaCl ; 5 mM MgCl2)
3、10xTBS(1L)：(0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)；1.5 M NaCl)
4、LB Broth(1L)：(10 g NaCl+10 g of tryptone +5 g of yeast extract)
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