多聚酶链式反应(PCR)基因扩增及琼脂糖凝胶电泳检测
一、 实验目的
通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。
二、 实验原理
PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下：
PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。
1.变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
2.退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。
3.延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。
琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5
ng以上的DNA。
三、实验材料及相关试剂
基因组DNA，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等
四、实验步骤
1．模板DNA的抽提：实验一所得的水稻基因组DNA。
2．PCR操作 (在冰上操作)：
（1）PCR反应混合液的配制：反应体系25 µL, 在无菌的0.2 mL离心管中按下列操作程序加样：
| 反应物 | 加样顺序 | 体积/µL | 终浓度 |
| ddH2O | 1 | 17.3×n | |
| 10 x Buffer | 2 | 2.5×n | 1 x |
| 25 mmol/L MgCl2 | 3 | 1.5×n | 1.5 mmol/L |
| 10 mmol/L dNTP | 4 | 0.5×n | 200 µmol/L |
| 10 µM上游引物 | 5 | 1×n | 0.4 µmol/L |
| 10 µM下游引物 | 6 | 1×n | 0.4 µmol/L |
| DNA Taq聚合酶 | 7 | 0.2×n | 1 U |
（2）将反应混合液混匀, 然后每个PCR管中分装24 µL反应混合液，再加1 µL模板DNA，最后加1滴石蜡油，防止水分蒸发, 然后稍离心。
（4）注意事项
由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。
a.所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作它用。
b.操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。
c.每加一种反应物，应换新的枪头。
3．PCR产物的检测：
琼脂糖浓度（1.2%）；EB浓度（5 µl / 100 ml TBE）
（1）制胶（以150 mL为例）
a.称取1.8 g 琼脂糖，加入150 ml 的TBE缓冲液（pH 8.0），摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。
b.电炉上加热，至琼脂糖完全溶解；然后在天平上加蒸馏水至原重量;
c.用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃），倒入其中，直至厚度为4～6 mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约30~ 45 min)；
d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。
（2）点样
a.将2.0 µl 溴酚蓝加入到PCR产物中，然后稍微离心；
b.每孔点样10.0 µl，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。
（3）电泳
打开电源开关，调节电压至3~5 V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约1小时后即可观察。
（4）染色
将电泳好的凝胶放入含EB的水溶液中, 染色15-20分钟。
（5）观察
将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。
（6）注意事项
a.煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。
b.煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。
c.倒胶注意厚度（4-6 mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后，放入4℃冰箱10多分钟，以加速胶的凝固。
d.加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。
e.一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。凝胶中含有EB，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。
