缺血修饰性白蛋白在冠心病心肌缺血诊断中价值循证评价
急性冠脉综各征（ACS）是由于急性心肌缺血导致的胸部不适和其它症状的一大类病症，是临床常见的心脏血管急症，也是造成急性死亡的重要原因。心肌缺血是ACS 最常见的发病机制，临床工作中，有相当部分症状隐匿而未收入院治疗的病人实际是心肌缺血患者，这些漏诊病人的死亡性比住院患者高1倍。因此，临床工作者一直致力于寻找一种灵敏的心肌缺血标志物，能在ACS 早期可逆阶段检出，从而有助于急性缺血患者的正确诊断和及时治疗。传统检查方法都不能作为诊断心肌缺血的“金标准”，尽管心肌缺血时可出现ST 段和T 波改变、局限性室壁运动异常或心肌灌注缺损，但急性胸痛患者常常缺乏以上客观检查征象；ECG 对于AMI 和UA 有较高的特异性，而灵敏度低于50% 。超声心动检查的应用因存在非缺血性室壁运动异常受到限制；核素显象只有在损伤心肌>10g 时才可检出，该检查成本高，难以推广；心肌肌钙蛋白（cTn 、肌酸激酶同功酶MB（CK-MB） 是特异的心肌损伤标志物，但发病后4－6h 才开始升高，且可逆性缺血情况下cTn 多为阴性。近年来广泛用于临床的心肌损伤标志物如心肌肌钙蛋白(cTn)、肌红蛋白(M b) 和肌酸激酶同功酶(CK-MB) 均在心肌坏死后血中浓度才升高，不利于在ACS 早期心肌损伤可逆阶段做出诊断。1999 年美国学者BarOr[1]观察到不稳定型心绞痛和心肌梗死发作早期患者的血清白蛋白(HSA ) 转化为缺血修饰白蛋白(IMA)。提示IMA 可用于心肌缺血的早期诊断。
IMA发现的历史
早在1990 年，1名急诊医生发现心肌缺血发作时人血清白蛋白（Human Serum albumin，HSA） 的化学性质可能会将发生改变，并发现HSA 和过渡金属元素如Co 、Cu 和Ni有很强的结合能力[2]；1992 年临床研究显示AMI 和UA 患者血清lMA 水平升高；1994 年有关MA 与IMA 的UA 关系第一ZL被申请；1997 年Iscies Tecies 公司投入资金对IMA 标志物进行商业开发；1999 年利用生化分析仪进行了白蛋白钴结合试验（ACB）；2000 年美国多中心临床试验显示在诊断ACS 时IMA 比TnI 敏感，Bar-Or 等[1]首先报告可用此来检查心肌缺血；2001年ACB 试验通过ISO9001 、ISO13485 、EN46001认可，并首先在欧洲销售；2003年2月美国FDA 批准可上市销售。在美国此项检测己列入医疗报销范围。
IMA的概念和形成机制
HSA 氨基末端序列为人类所特有，是过渡金属包括铜、钴和镍离子主要的结合位点，组织缺血时释放的产物使循环血液中的部分HSA 氨基末端结合位点改变，与金属离子结合能力下降，这部分发生了改变的HSA 就称为IMA 。IMA 在血液中浓度升高就提示发生了组织缺血。
冠状动脉缺血时IMA 产生的确切机制尚不清楚, 各种观点尚有矛盾，但已定位在HSA 氨基末端N-天门冬氨酸(Asp)-丙氨酸(Ala)-组氨酸(His) -赖氨酸(Lys) 序列的变化上。当冠脉局部血液和氧供减少，组织细胞进行无氧代谢, 代谢产物乳酸堆积，导致酸中毒，局部微环境PH值下降，致使Cu 2+ 从循环蛋白的结合位点释放，在还原剂作用下转化为Cu1+，Cu1+ 与氧反应生成超氧自由基, 后者岐化为过氧化氢（H2O2）和氧。H2O2可通过Fenton反应形成羟自由基，羟自由基损害HAS，使N基末段序列的2-4个氨基酸发生N乙酰化或缺失，转化为IMA。
由于各种原因引起缺血时，局部血液灌注和供氧减少，组织细胞进行无氧代谢，消耗ATP 。同时代谢产物（如乳酸）堆积，局部微环境PH 值下降，致使（Cu2+） 从循环蛋白的金属结合位点释放， 在还原剂如维生素C 存在时，Cu2+ 被转化为Cu+。后者可与氧反应生成超氧自由基在超氧化物歧化酶的作用下将其歧化为过氧化氢（H2O2） 和氧。正常情况下， H2O2 是无害的，由过氧化物酶降解成水和氧气，而当有金属分子存在时，H2O2 可通过Fenton 反应形成羟自由基(OH)。后者具有高度活性，导致蛋白、核酸损伤和脂质过氧化。HAS 易受OH损害，使N 末端序列的4个氨基酸发生改变，形成IMA 。有报道，缺血情况下，氨基末端被乙酰化或缺失2 个氨基酸[7，8] 转变为IMA 。在这一过程中，游离Cu2+ 具有很高的毒性作用。游离Cu2+ 释放后，血清白蛋白的N 端序例与其结合，迅速将其清除，当白蛋白在作用下被修辞后，结合Cu2+ 的能力减弱，Cu2+ 从结合位点释放，再次进入OH 形成过程或与正常的白蛋白结合，这就形成一个链式反应，最终使IMA 在缺血后数分钟内迅速升高。
2．Wu A H B, Morris D L, Fletcher D R, et al. Analysis of the album in cobalt binding(ACBTM) test as an adjunct to cardiac troponin I for the early detection of acute myocardial infarction[J ]. Cardiovascular Toxicology, 2001, 1(2): 147
IMA的释放动力学
常见实验动物如狗、猪、鸡的血白蛋白结构或组成与人类不同, 体内缺血发作时观察不到IMA 升高。人体模型通过经皮冠状动脉腔内成形术诱导短暂心肌缺血得以实现。Bar-O r等[3]对41 例接受选择性PTCA 患者进行研究，发现术中球囊扩张压迫> 3min可引起短暂缺血, 而且在缺血性改变后数分钟内即出现IMA 升高，PTCA 后6 h IMA 回复至基线，并可通过白蛋白-钴比色法将IMA 的变化检测到。Sinha 等[4] 对接受经皮冠状动脉介入手术(PC I) 的19 例慢性稳定性心绞痛患者(均为单支病变，一支主要冠状动脉狭窄大于70%，无明显侧枝循环形成) 的IMA 水平实施了动态观察，分别于PCI前和球囊扩张后即刻从导引导管、PC I 后30 min 从股动脉鞘管采取血样，PCI后12 h采集外周血。PCI 期间19 例患者均出现了胸痛，18 例有短暂的缺血性ST 段改变。结果显示，PCI 后即刻IMA 中位数水平高于基线值，至少持续30min，于12h回复至基线水平。可见IMA 变化明显早于心肌坏死标志物（cTn、CKMB和Myo）。
心脏特异性
从理论上讲，心肌以外组织或器官缺血也可产生IMA ，但目前在其他组织如骨骼肌缺血和循环缺氧当时，较少观察到IMA 升高，提示IMA 可能具有心脏特异性，但具体机制尚未完全阐明。App le 等[5] 测定了19 名马拉松比赛参赛选手比赛前(基线)、赛后即刻(比赛结束后30min 内)，和赛后24-48 h的血浆IMA 水平。测定结果显示，赛前有6名选手(81-91 ku/L ) IMA 水平略高于参考上限(80 ku/L)，赛后即刻全部在参考范围之内(mean= 49 ku/L)，赛后24-48 h，所有选手显著升高(mean=84ku/L)，其中12 名选手高于参考范围上限(81-110 ku/L)。研究结果表明：马拉松比赛这样的负荷，IMA 在短期内未升高，提示白蛋白-钴结合测定至少在短期内不受骨骼肌肉组织缺血的干扰。赛后24-48小时的IMA升高可认为是由于胃肠道缺血所致或是对骨骼肌缺血的一种延迟反应。这也提示IMA对心肌缺血的特异性具有时间限制。Roy 等[6] 观察了外周血管病变并运动诱导骨骼肌缺血时IMA 的变化。实验发现：所有患者踏车运动试验达峰值时明显下降，1h 后回到基线水平，与外周血管病变成明显负相关(r= 20. 4，P < 0. 05)。这提示患者外周血管病变运动诱导腿缺血即刻IMA 明显降低，并与疾病的严重程度相关。在IMA 作为心肌缺血的标志物时应考虑外周血管病变的影响。
IMA检测方法
1．检测原理：正常白蛋白以活性形式存在，加入钴试剂后，Co2+与白蛋白N-末端结合，溶液中存在的游离Co2+浓度较低，而心肌缺血患者血清标本中含有较多的IMA，加入同等量的钴试剂后，由于IMA 与Co2+的结合能力降低，溶液中存在较高浓度的游离Co2+，加入DTT 试剂后可与游离Co2+ 产生络合反应，在470 nm 处测定吸光度大小，吸光度高者表示血清中存在较多的IMA。
2．检测方法：
2.1．比色测定法：IMA 检测是以心肌缺血可引起HSA 的蛋白-钴结合实验测定白蛋白与外源性Co (LL) 结合的能力间接测定IMA 含量。第一代比色测定法由Bar-O r 等[1,7] 建立，手工操作，结果以吸光度单位表示，整个测定过程仅需要12min 左右。具体测定步骤是：取待测血清200mL，加入0. 1% 氯化钴(CoCl2·6 H2O) 水溶液50mL，混合后搁置10m in 。然后加入1.5mg/mL DTT 水溶液50mL, 2min 后再加入0. 9%NaCl 溶液1.0mL 。使用分光光度计，在470 nm 处读取吸光度单位，空白管除不加DTT 外，余同测试管。本法批内CV 为4. 1%，批间CV 为3. 8% [3 ] 。新一代的白蛋白-钴结合实验由美国Ischemia Techno logies 公司生产供应, 可在Cobas M IRA PLU S 、Cobas FARA 、KoneL ab20、日立911 等多种分析仪上进行, 结果用u/mL或ku/mL 表示。本法线性范围分别在6～186 u/mL 和14 ～200 u/mL 之间, 特异性高, Co (LL ) 与免疫球蛋白(1～ 8g/dL )、Cohn FractionIII (2～10g/dL )、a2-巨球蛋白(0. 1～ 0. 8g/dL ) 和去白蛋白血浆(1～5g/dL ) 等蛋白质未发生结合，且不受肝素(415 u/mL )、血红蛋白(1000mg/dL )、胆红素(600～700mg/dL ) 和三酰甘油(500～779 mg/dL ) 的影响，平均回收率为98% 。
2.2．其他检测方法：除比色测定法外，已报道的测定白蛋白-钴结合的方法还有液相色谱法、质谱测定法以及核磁共振等，但均不太适合临床常规分析。
缺血性修饰白蛋白（IMA）与早期诊断心肌缺血
IMA 与传统的心肌坏死指标不同，在心肌缺血发作后5-10 min 血中浓度即可升高，而不需发生心肌细胞的不可逆损伤，能够辅助临床医生早期明确缺血的诊断，早期干预治疗，改善患者的预后和减少病死率。
Bar-Or 等[3] 测定139 例急性胸痛发作4h 内到达急诊科患者的IMA 水平，研究白蛋白-钴结合实验用于鉴别急性胸痛的意义。结果显示，99 例心肌缺血者的吸光度单位(均数±标准差为0.519±0.086) 明显升高，与非缺血组(0.316±0.092) 相比有统计学意义。其中缺血组中95例大于判定阈值(0.40 吸光度单位)，敏感性达96%，而非缺血组中37 例小于判定阈值(0.40 吸光度单位)，特异性92.5%。该研究表明IMA 有可能成为急性心肌缺血早期生化指标。Bhagavan 等[7] 以可疑心肌损伤就诊急诊科的患者为研究对象，采集了75 例心肌缺血患者和92 例非心肌缺血患者的血样，测定其血清白蛋白-CoCl 结合能力，用ROC 曲线分析评价其诊断意义，并求最适诊断界点。结果显示在临界点为0.50 吸光度单位时，检出心肌缺血的敏感性和特异性分别是88% 和94%，阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV) 分别是92% 和91%，证实IMA对ACS 的早期诊断价值。
Sinha[8] 等对208名疑似ACS 患者进行临床研究，以评价IMA 检测的意义并比较了IMA 、ECG 和cTnT 对ACS 的早期诊断效能。所有入选患者均在出现急性胸痛后3h 内到达医院，入院后2h 描记ECG，采血测定IMA 和cTnT。IMA 中位数值急性冠脉综合征(95. 4u/mL，n= 131) 与非缺血性胸痛(86. 2u/mL，n = 77)比较、UA(97. 3u/L, n=85)与非缺血性胸痛和AMI(93. 2u/L, n=46)比较均显著升高。再次证实IMA确可用于ACS早期诊断，且可区分AMI和UA，尤其对于UAP诊断具有优势敏感性达91%。IMA单独用于诊断ACS的敏感性是82%，心电图与cTnT联合敏感性仅为65%，三者联合敏感性达95%，心电图与cTnT联合诊断ACS时ROC曲线下面积为0.74，再联合IMA是ROC曲线下面积提高至0.83。可见ACS发病早期IMA确实能够提高传统检查方法的诊断效能。Sinha的结论认为IMA的应用有望改进现行的急性胸痛患者诊断策略。见表1
表1 各种心肌标志物对ACS 的诊断性能
| 心肌标志物
| 灵敏度%
| 特异性%
| ROC 曲线下面积
|
| IMA
| 82 | 46
| 68 |
| ECG | 45 | 91
| 68 |
| CTn | 20 | 99
| 64
|
| ECG +cTn | 53 | 90 | 74
|
| IMA+ECG
| 92 | 43 | 77 |
| IMA+cTn
| 90 | 44 | 88
|
| IMA+ECG+cTn | 95
| 42 | 83 |
Stejskal等[9]再次验证了白蛋白-钴结合试验对ACS做出早期诊断的可能性。试验纳入98名疑似ACS患者，所有入选患者在入院即刻、2h、6小时和12小时采血测定cTnI、肌红蛋白及白蛋白-钴结合能力，并根据最终诊断分为ACS组与非ACS组，ACS组进一步分为AMI和非AMI组。结果显示，在入院即刻、2小时、6小时ACS组与非ACS组比较ACB值明显升高（即刻：0.62±0.17比0.4±0.11；2小时：0.61±0.13比？；6小时：0.58±0.16比0.45±0.1），入院12小时时ACB值不适于ACS的诊断。但ACB值不能区分AMI与非AMI这一点与先前报道不一致。
