一、材料和试剂 1. 抗原致敏供者的单个核细胞(MNC)和经过3 300 rad照射的自身MNC 2. 抗原 3. 含10%人AB型血清的完全RPMI 1640培养液 4. 细胞分离及T细胞培养增殖所需的其他试剂和器材 二、操作步骤 1. 抗原刺激:于24孔培养板加入单个核细胞5×106 /2 ml/孔和最适浓度的抗原,置37℃,5% CO2 温箱培养7 d。 2. 间歇循环刺激: (1)重悬经过抗原刺激的细胞,并经密度梯度离心,收集界面层细胞,用无血清的RPMI-1640洗二次; (2)调整细胞浓度至1×106 /ml,加入24孔培养板孔中,同时各孔加入经过照射的自身MNC 4×106 ,以未照射的自身细胞作为饲养细胞和抗原提呈细胞,培养7d; (3)同步骤(1)收集和洗涤细胞; (4)调整细胞浓度至1×106 /ml,与2~3×106 新鲜照射的自身MNC及抗原共同培养7d; (5)重复步骤(2)~(4)共3个循环; (6)收集细胞,通过增殖试验测定抗原的特异性。 3. T细胞克隆:间歇循环刺激培养的细胞经有限稀释,于96孔板依次加入不同浓度的细胞悬液,同时克隆板孔中加入104 经过照射的自身MNC、IL-2 30 U和适当浓度的抗原,同上述条件培养7~10 d,显微镜下观察细胞生长情况。将生长良好的抗原特异性细胞转至24孔板孔中,加入自身饲养细胞和抗原,继续培养7 d,传代并经间歇刺激培养。 展开 |