正常角膜缘干细胞的免疫染色实验
正常角膜缘干细胞的免疫染色
试剂和材料：
1. 一抗：
（1） ABCG2-----------------小鼠单克隆BXP-21---------1：100
（2） 连接蛋白-43-----------兔多克隆CX43-------------1：100
（3） 细胞角蛋白3（K3）-----小鼠单克隆AE5----------- 1：500
（4） 细胞角蛋白12（K12）---兔多克隆J7-------------- 1：200
2. 二抗；
（1） 抗小鼠IgG-------------Alexa-488----------------1:2500
（2） 抗兔IgG---------------Alexa-546----------------1:1500
3. 封闭抗体：PBSA配制的10%热灭活羊血清；
4. Trion X-100；
5. PBSA；
6. 多聚甲醛（PFA），将16%原液用PBSA现配成4%的工作浓度；
7. Immu-Mount防褪色封片剂；
8. 载玻片和#1盖玻片；
9. 共聚焦显微镜；
实验方法：
1. 培养在塑料平皿或羊膜上的细胞；
2. CMF-Saline G洗一遍；
3. 用新鲜配制的4% PFA室温固定15min；
4. PBSA洗一遍；
5. 0.1% Triton X-100破膜10min；
6. 样本与一抗室温孵育1h；
7. PBSA洗2遍；
8. 加入二抗室温孵育1h；
9. 用PBSA洗2遍；
10. #1盖玻片，用最小体积的防褪色的封片剂封片；
11. 在荧光或共聚焦显微镜下用40×油镜对样本进行观察
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