基因技术专题-2
| RNAi技术RNA干扰(RNA interference， RNAi)是近年来发现的研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术，它利用了由小干扰RNA(small interfering RNA， siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRNA的翻译。RNAi是生物进化的结果，是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应。它普遍存在于各种生物，具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达ｍRNA的生物学功能。RNA干扰现象不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且有可能在基因功能测定，基因治疗等方面开辟一条新思路。1 RNAi的历史背景20世纪20年代，人们发现，植物受到野生型病毒感染后，能产生对另一种亲缘关系相近的病毒的抵抗力。而真正发现双链RNA(dsRNA)能引起基因沉默现象，则在1995年。当时，Guo和Kemphues用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)中parl基因的表达时发现反义RNA具有抑制该基因表达的功能，同时正义RNA也同样出现了类似的抑制效应，实验表明正义RNA和反义RNA均能阻抑基因功能表达，而且两者的作用是相互独立的，机制也各不相同。1998年，Fire和Mello等人首次发现dsRNA能够特异地抑制C.elegans中的纹状肌细胞unc-22基因的表达，结果发现dsRNA所引起的基因沉默效应要比单单应用反义RNA或正义RNA强十几倍。而且注射入C.elegans的性腺后，在其第一子代中也诱导出了同样基因的抑制现象，说明在原核生物中，RNAi具有可遗传性。他们将这一现象称为RNAi。因为RNAi作用发生在转录后水平，所以又被称为转录后基因沉默(PTGS)或共抑制。此后，又在果蝇、锥虫、涡虫、无脊椎动物、脊椎动物、植物、真菌、斑马鱼及哺乳动物等真核生物中发现了RNAi现象。不同领域中的发现促使人们思考它们之间的可能联系。RNAi在果蝇中得到证实的同时，发现转座子翻转移位可启动RNAi，而转座子翻转移位所造成的同源基因沉默很似植物中的共抑制；在线饱霉实验中，发现PTGS过程中所必须的蛋白QDE1与RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)同源，提示PTGS过程中可能涉及到RNA复制及调节作用。同样在植物韧皮部注射dsRNA可遍及扩散到整个植株体产生RNAi；更有趣的是，把线虫浸润到含有dsRNA液体中或喂养表达dsRNA的工程菌也可以诱发RNAi。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。2 RNAi的作用机理目前对RNAi的作用机理尚不清楚， RNAi是由dsRNA诱导的多步骤、多因素参与的过程，属于基因转录后调控，其中需要ATP的参与。通常认为dsRNA由核酸内切酶(RNA se Ⅲ)切割成21～23bp的siRNA (在果蝇RNA se Ⅲ 被称为 dicer)，siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、螺旋酶)结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC，然后RISC再特异性地与ｍRNA的同源区结合，通过酶的作用使ｍRNA降解，而产生基因沉默。靶ｍRNA被破坏后， RISC还可以再作用于其它靶分子。siRNA还具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于30bp的dsRNA可引起机体非特异性干扰素样反应和蛋白激酶(PKP)的激活而使其被降解，从而大大减少了其对ｍRNA的抑制作用。3 RNAi的特点 RNAi被美国科学杂志评为2001年十大科技突破之一，科学家对RNA干扰现象之所以表现出极大关注在于RNA干扰在基因功能和相关方面的研究中具有许多传统方法无法比拟的特点和优势。RNAi有7个重要特征3.1 RNAi是dsRNA介导的PTGS机制在此过程中，注射该基因的内含子或者启动子顺序的dsRNA都没有干涉效应。翻译抑制剂对RNAi不产生影响。3.2高特异性RNAi只能特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，而其他mRNA的表达则不受影响。3.3高效性无论是在体内还是体外实验中，仅需少量的dsRNA(几个数量级浓度)就能有效的抑制靶基因表达，抑制的效率在低等动物中>90%。这表明dsRNA介导的RNA干扰是一个以催化放大的方式进行的。3.4 dsRNA长度限制性引发有效iRNA的dsRNA需要一个最小的长度。dsRNA小片段如小于21～23nt(如10～15nt)，特异性将显著降低，不能保证不与细胞内非靶向基因相互作用，如远远大于21～23nt，互补序列可能延伸，超出抑制范围。3.5 RNAi有浓度、时间双重依赖性dsRNA诱发的RNAi效应的强度随着其浓度的增高而增强。高浓度的dsRNA产生较多的siRNA，不仅能增强反应体系的效应，而且还能抵消ADARs(RNA依赖的腺苷脱氨酶)的作用。实验表明，RNAi在哺乳动物细胞中只能维持一段时间，干扰效应通常出现在注射dsRNA 6h后，可持续72h以上。3.6可传播性基因表达的效应可以跨越细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给子一代。3.7 ATP依赖性在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应是必须由ATP提供能量。4 RNAi技术的应用与展望依据RNA干扰现象，科学家建立了RNA干扰技术，即人为设计合成针对某特定基因序列的dsRNA来关闭或抑制该基因的表达。但RNA干扰已被证实是一种特异、高效、经济的使基因表达受抑的技术手段。它可有效地将靶基因的表达水平降到一个低的水平，甚至于完全的清除。美国麻省理工大学医学中心Phillip Zamore预言“RNA干扰将在哺乳动物细胞遗传学上引起革命性的变化。”人们不再需要花6个月的时间设法去关闭某个基因的表达，利用这项技术，可以在一周之内就可关闭10个基因。4.1 RNAi技术可发挥重要的作用4.1.1研究基因功能 与使用基因敲除技术来检测基因功能相比，RNAi技术却能方便，快捷的达到这一目的，即使是在一般条件的实验室也可开展这项工作。利用RNAi技术，科学家已对几乎全部线虫基因(大约19000个基因) 功能进行分析检测。Wianny也报道用dsRNA来阻断小鼠早期胚胎特异基因，包括卵母细胞的c-mos和早期胚胎E-cadherin及GFP转基因的表达。4.1.2抗病毒作用我们可将病毒在复制中起关键作用的基因作为目标设计dsRNA来抑制病毒的复制。自1986年植物学家首次利用转入烟草花叶病毒(TMV)的核衣壳(CP)基因导入植株培育出抗病毒植株后，已培育了一大批抗病毒植株。4.1.3研究转基因沉默机制在植物的转基因试验中，经常发生基因沉默。因此，对转基因沉默机制的探索可以为在转基因研究中避免基因沉默提供对策。4.1.4基因治疗 RNAi作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的等位基因的表达而达到治疗目的，但又不影响正常等位基因。Wilda等在白血病细胞K562试验中，用对M-BCR/ABL融合基因特异的siRNA转染K562细胞，发现K562细胞中相应的mRNA被清除，并出现强烈的细胞凋亡现象。4.2 发展前景通过实验手段将dsRNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其序列同源的ｍRNA，封闭内源性基因表达，从反向遗传的角度研究人类或其他生物基因组中未知基因的功能。近来也有实验报道通过RNAi研究细胞内脂质平衡过程中涉及的各条途径。在这之前，曾利用反义RNA与靶ｍRNA序列互补的特性来抑制其表型的发生，但由于反义RNA对内源性表达的基因抑制作用较弱，往往会产生一些过渡表型，易造成对基因功能判断错误，目前已通过审批认为临床上具有治疗作用的仅有一种药物——Vitravene。RNAi技术与之相比，特异性更高，作用更迅速，副反应小，在有效地沉默靶基因的同时，对细胞本身的调控系统也没有影响。几乎所有包含已知基因编码序列的dsRNA都能够在体外特异性抑制该基因的功能，类似于基因敲除的效果，基于这些特点，RNAi已被发展成一种探查基因功能的有力工具。线虫中，通过RNAi检测单个基因功能的分析方法现已扩展为分析整个蠕虫中存在的19000个基因功能的一种有效方法。相似的策略在植物及其它生物中也得到应用。RNA干扰研究前沿和应用领域 一． 外源RNA诱导RNAi的应用 1. 基因功能研究 从2001年《Nature》杂志上首家报道在哺乳动物培养细胞中通过siRNA成功诱导了特异性靶基因表达沉默后，RNA干扰技术就作为一项特异性基因沉默的有效工具从低等生物成功进军哺乳动物领域。2003年Rubinson DA等又在Nature Genetics上报道用病毒系统在原代哺乳动物细胞，干细胞和转基因小鼠上都取得了RNA干扰成功，更大大扩展了这项技术的应用范围。研究者们可以利用这项技术对目标基因进行特异性地表达沉默，通过观察其表达被抑制后细胞以至生物体从形态到各项生理生化的变化，对该基因的功能及参与的信号网络进行研究。这比传统的基因敲除方法要简单而且方便得多，因此短短几年，就有了很多突破性的成果。其中研究得最多的是跟疾病相关的一些基因，不仅对疾病机制及相关代谢网络有了进一步认识，也为基因治疗及药物筛选提供了一些借鉴。 在具体诱导方式方面，目前报道的成功的siRNA形式多样，其中短发夹结构RNA（shRNA，short hairpin RNA）表达载体的应用大大加快了研究者从最初的培养细胞水平扩展到成体水平的步伐。例如，在神经生物学研究中，美国NIH的Backman C等通过siRNA表达质粒对中脑腹侧神经细胞中的多巴胺能相关基因进行了有效抑制， Hommel JD等还通过病毒介导的RNAi建立了此类成年小鼠模型，不仅为建立神经系统的功能缺失模型找到了一些有价值的表型标记，对神经系统的基因治疗也有一定借鉴意义；在癌症研究中，Zhang Y等也通过shRNA表达载体成功抑制成年大鼠脑癌基因，并对RNAi的远程（穿过血脑屏障）基因沉默方法进行了非常有益的探索；利用细胞凋亡途径，Zender L等通过RNAi抑制凋亡基因Caspase－8能提高患急性肝功能衰竭小鼠的成活率，并发现Caspase 8 siRNA处理对特异性Fas 激活剂（Jo2和AdFasL）和野生型腺病毒介导的急性肝功能衰竭都有效，表明这个动物模型能反应人类急性病毒肝炎多分子参与的机制，增强了siRNA用于急性肝炎病人治疗的希望…… 除了对某些关键基因的RNAi研究外，Zheng L等还在哺乳动物细胞中探索了siRNA在基因组水平上的筛选方法。他们建立了一个包含8000多个基因的siRNA表达框文库阵列，通过它来高通量筛选NF-kB信号途径中已知的及Unique基因。由此可见，RNA干扰也正作为筛选成百甚至上千基因的工具，发挥着越来越大的作用。 总的来说，RNA干扰为系统地抑制RNA分子合成蛋白提供了快速而相对简便的途径。通过在一段时间内对一个基因RNA信号的抑制，研究者可以深入研究基因功能，进而开始描绘支配从细胞形态到信号系统的遗传网络。 2. 基因治疗及药物筛选探索 由于RNA干扰是针对转录后阶段的基因沉默，相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除，整个流程设计更简便，且作用迅速，效果明显，为基因治疗开辟了新的途径。其总体思路是通过加强关键基因的RNAi机制，控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复制及表达。尤其针对引起一些对人类健康严重危害的核酸病毒，如去年在全球多个国家和地区流行的SARS这种主体是单链核酸的新型冠状病毒，寻找药物靶点，设计核酸药物就更加方便。目前已经有很多公司在积极开发这方面的药物，如在去年SARS药物研究中一鸣惊人的美国俄勒冈州的AVI BioPharma生物制药公司等。国内也有很多研究机构及生物技术公司投入了这方面的工作。如上海生科院成立了SARS防治科研攻关领导小组，其中生化细胞所和药物所的一些课题组在从RNA干扰的角度努力。此外，北大，中南大学，北京动物所等大专院校研究机构以及北京金赛狮反义核酸技术开发有限公司等也开展了RNA干扰药物的研究与开发。 基因治疗方面去年最引人注目的进展之一是对肝炎的RNA干扰研究。McCaffrey AP等通过表达shRNA的载体在培养细胞水平和转染HBV质粒后免疫活性缺失的小鼠肝脏中成功抑制了HBV复制。与对照相比，小鼠血清中测得的HBsAg下降84.5％，免疫组化对HBcAg的分析结果下降率更超过99%。另，哈佛大学Lieberman的研究小组通过注射针对Fas的siRNA，过度激活炎症反应，诱导小鼠肝细胞自身混乱。然后给测试小鼠注入使Fas hyperdrive的抗体，发现未进行siRNA处理的对照组小鼠在几天中死于急性肝功能衰竭，而82%的siRNA处理小鼠都存活下来，没有患病，它们当中80-90％的肝细胞经证实结合了siRNA。并且，RNAi发挥功能达10天，三周后才完全衰退。由于Fas很少在肝细胞外的其它细胞高表达水平，对它的抑制对其它器官几乎没有副作用。 此外，这个小组还和其它研究者积极开展针对HIV的RNAi测试，目前报道他们使用的针对CCR5蛋白的siRNA能阻止HIV进入免疫细胞约三周，在已经感染的细胞中也能阻止感染病毒的复制。 然而，尽管取得了不少成果，要真正用于医疗还需时日。目前大多数还停留在小鼠测试阶段，siRNA的导入多采用静脉或腹腔注射，尾部注射，细胞移植等，如何对人进行有效的给药，既能确保药效在靶器官靶组织有效释放，还要具有高度安全性等等问题都尚需进一步研究。我们期待着RNAi引领的新医学革命的到来。 在药物筛选领域，除了线虫这种低等动物的RNAi高通量药筛模式外，2003年Lavery KS等的综述中也对RNAi在药筛领域的应用前景进行了高度评价：RNAi技术将逐渐成为药物靶点筛选和鉴定的强大工具。他对如何在药筛的各个阶段应用RNAi做了具体描述及展望，并指出将这项技术与高通量筛选，体外生物检测和体内疾病模式相结合，将提供大量基因功能方面的有用信息，在药物开发过程的多个阶段促进靶点的筛选。 二． 内源RNAi机制及功能研究 是什么原因使我们有可能通过外源siRNA诱导内源性的靶基因转录后沉默？为解开这个迷题，更有效地进行RNAi应用，随着RNAi应用研究的广泛开展，生物体内部RNAi机制研究也愈加深入，并迅速成为RNAi研究中的重要领域，吸引着越来越多的研究者投身其中，涌现出一系列令人耳目一新的成果。 多年来，生物学家认为RNA在生命过程中的作用仅仅是将遗传信息从DNA传递到蛋白，就象蜂群中的雄蜂般没有创意。但近几年的一系列发现使研究者对RNA，尤其是mRNA以外的哪些小RNA的功能有了全新的认识。生物体中有一群小RNA（目前看来人体中编码约255种小RNA，竟占整个基因组近1%，很多可能编码自以前被认为“垃圾DNA”的区域），它们也可通过自身的RNAi机制，在生命过程的各个阶段关闭或调控基因表达水平，从而控制细胞的多种生命活动。尤其在发育过程中2003年有一些激动人心的最新发现：仅约22个核苷酸长度的小RNA，发现竟能引导早期发育――从使植物叶片成形到介导果蝇胚胎在植物组织中的细胞增殖；缺少RNAi蛋白Dicer（一种RNA酶III家族的酶，参与RNAi过程中对RNA的剪切）的小鼠会缺少干细胞的某些分化系（swaths of stem cells），在出生前就夭折；小鼠中特定的小RNA能帮助引导干细胞生成胚胎的血细胞系统。 此外，有些RNAi现象能在DNA编码不变的情况下传代，甚至在一些物种中对基因组进行调整，有人形象地比喻它为“引导基因组的手”，生动体现了小RNA源于基因组但对基因组所具有的强大反馈作用。 《Science》上一篇题为“RNAi Extends Its Reach”的综述详细阐述了RNAi途径已经不仅仅限于沉默mRNA，还作用于基因组。这方面的具体机制还不是非常明确，但在植物中发现伴随有DNA甲基化现象，科学家们预测要描绘一张完整的RNA引导基因组改变的图谱可能需要对RNA信号，DNA甲基化和组蛋白修饰之间的相互作用进行更进一步的研究。 综合来看，我们可将目前报道的内部RNAi机制可能的功能，大致分为以下几类： 1. 抗病毒功能 Voinnet和Li等分别在植物和果蝇中发现了通过RNAi实现的抗外源核酸机制：被大多数RNA病毒启动的RNAi可导致病毒基因组降解。例如在果蝇细胞中， Flock house virus (FHV)就能引发果蝇内部的RNAi反应，产生FHV特异性的siRNA来降解感染的FHV。 2. 基因调控 目前在人、蠕虫，果蝇和植物等生物体中都发现了小RNA，有的通过结合3'非翻译区（UTR ）和靶mRNA抑制mRNA翻译，有的作为siRNA通过RNAi机制破坏靶基因转录本，对基因表达水平进行调控。 3. 染色质浓缩 内源的siRNA，一些小RNA可能通过使染色质浓缩调节基因表达。一些研究小组发现dsRNA结合到植物启动子区域能通过一种使DNA甲基化的作用导致基因沉默；在蠕虫体内检测到许多Polycomb 蛋白（能结合染色质）是RNAi过程所必须的；裂殖酵母中内源siRNA可介导中心粒区染色质浓缩，导致这个位点的基因转录沉默。如Vera Schramke等在裂殖酵母中通过合成shRNA反式抑制同源位点，导致在mate区沉默的Swi6染色质浓缩。这些结果都提示一些内源性的siRNA通过导致染色质浓缩来调节基因水平。 4. 转座子沉默 目前，两方面的证据提示转座子沉默涉及siRNA。其一，发现蠕虫mut-7基因参与RNAi和转位抑制。其二，从裂殖酵母的中心粒区也分离出siRNA，并检测到这些siRNA介导此区内组蛋白甲基化。由于中心粒区包含重复序列――含转座子片段，在一些减数分裂基因中也发现了通过其附近的逆转录转座子LTR（长末端重复序列）介导的RNAi，推测在siRNA介导的中心粒区域的组蛋白甲基化可能源于古老的转座子沉默作用。 5. 基因组重组 siRNA可能参与纤毛虫，四膜虫虫体间结合时的基因重组。结合到重组序列的siRNA，在虫体之间的结合过程中介导DNA缺失和染色体断裂。有趣的是，在这些siRNA介导的程序性DNA删除事件中，也发现需要重组区域组蛋白的甲基化。 | ||
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