植物脯氨酸检测试剂盒(茚三酮比色法)使用说明
植物脯氨酸检测试剂盒(茚三酮比色法)
Plant Proline Assay Kit with Ninhydrin
● 产品组成：
| 组分货号 | 名称 | 规格 | 贮存 |
| PP5040-01 | 试剂1-Pro裂解液 | 100 ml | RT |
| PP5040-02 | 试剂2-Pro标准液 | 1 ml | 4℃ |
| PP5040-03 | 试剂3-Pro显色液 | 50 ml | RT 避光 |
● 产品简介：
脯氨酸(Proline，Pro)是一种环状的α-亚氨基酸，呈中性，等电点为6.30，易溶于水。在正常环境情况下脯氨酸含量较低，但在逆境下(旱、热、冷、冻、盐碱等)，脯氨酸常有明显积累，即积累指数与植物的抗逆性有关。植物脯氨酸检测试剂盒(茚三酮比色法)检测原理是脯氨酸与茚三酮共热发生反应，能产生稳定的红色产物，以分光光度计测定处吸光度，在一定范围内颜色深浅(即吸光度)与脯氨酸浓度成正比。
该试剂盒不使用传统的磺基水杨酸和甲苯等有害溶剂，经济环保。
该试剂盒主要用于测定植物组织中的游离脯氨酸含量，不适用于动物及医疗样品中脯氨酸的测定。
按照一次使用1 ml Pro显色液计算，试剂盒可以使用50次。
● 自备材料：
植物根茎、叶子等；剪刀；螺盖离心管或锁盖离心管或96孔板；1ml玻璃比色皿；分光光度计或酶标仪；水浴锅或干浴器；离心机
● 操作步骤：
1、 样本处理：
取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，剪碎，迅速称取， 按照20mg重量加入1ml Pro裂解液的比例加入Pro裂解液（建议使用1.5ml螺口离心管或锁盖离心管），沸水浴或干浴处理20分钟 (期间间歇混匀)，10000rpm离心 2分钟，上清即为脯氨酸提取液，4℃保存备用。待测提取液如不能及时测定，应置于-20℃保存，1-2天内稳定。
2、 Pro显色液的配制：
把小管装的茚三酮粉末，全部加入到茚三酮溶解液中，剧烈混匀至完全溶解，即配成Pro显色液。注意：Pro显色液具有一定腐蚀性，请小心操作。
3、 配制系列脯氨酸标准溶液：
取1ml 试剂1-Pro裂解液全部加入到装有Pro标准液的小管中，混匀后彻底溶解，即配成的Pro标准液（100mg/ml）。
取1 μl 100mg/ml 标准液加入到1ml Pro裂解液中，即配成100μg/ml Pro标准液待用。参照下表配制1-6号不同浓度的Pro标准溶液。
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 100μg/ml Pro标准液加入量（ml） | 0.01 | 0.02 | 0.04 | 0.06 | 0.08 | 0.10 | 0.15 | 0.2 |
| Pro裂解液（ml） | 0.49 | 0.48 | 0.46 | 0.44 | 0.42 | 0.4 | 0.35 | 0.3 |
| 脯氨酸含量（μg） | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 15 | 20 |
4、 样品测定:
= 1 \* GB3 ① 分光光度计测定：参考下表设置反应混合液，依次加入试剂：
| 空白管 | 标准管 | 测定管 | |
| 试剂1-Pro裂解液 | 0.5 ml | - | - |
| 步骤1中的脯氨酸提取液 | - | - | 0.5 ml |
| Pro标准液（步骤3中1-8管） | - | 0.5 ml | - |
| 试剂3-Pro显色液 | 1 ml | 1 ml | 1 ml |
= 2 \* GB3 ② 酶标仪测定：参考下表设置反应混合液，依次加入试剂：
| 空白管 | 标准管 | 测定管 | |
| 试剂1-Pro裂解液 | 50 μl | - | - |
| 步骤1中的脯氨酸提取液 | - | - | 50 μl |
| Pro标准液（步骤3中1-8管） | - | 50 μl | - |
| 试剂3-Pro显色液 | 100 μl | 100 μl | 100 μl |
③ 水浴煮沸或干浴20分钟，间歇混匀。加热时务必注意避免液体暴沸溅出，可使用锁盖离心管或螺旋盖离心管。
④ 冰浴或流水冷却至室温，10000 rpm离心 2分钟，如发现没有不溶物，也可以不离心。
⑤ 取上清，用空白管作为对照，用分光光度计或酶标仪检测分别测定反应混合液520nm吸光度值。
5、 计算：
以系列脯氨酸标准(1-6号管)含量(μg)为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，制作标准曲线，根据测定管的吸光度进而计算其脯氨酸含量。
植物组织样品脯氨酸含量(μg/g)=（C×VT）/(W×VS)
C=从标准曲线上查得的脯氨酸含量(μg)
VT=步骤1中脯氨酸提取液总体积(ml)
W=步骤1中使用的样品鲜重(g)
VS=步骤4中测定时加入的脯氨酸提取液体积(ml)
