登革热IgM ELISA试剂盒说明书(捕获法)（一）
应用范围
DENV Detect IgM Capture ELISA是一种用来检测人是否感染登革热病毒的ELISA检测系统，它可以检测出人血清中是否存在抗登革热病毒源性重组抗原（DENVRA）的IgM抗体。此诊断实验用于有登革热发热或是登革热血热临床症状的病人检测。阳性结果必须经过蚀斑减少中和试验（PRNT）或是根据CDC疾病诊断指南确证。
用于脐带血检测，新生儿测试，产前筛查，或是普通人群筛查的实验特征性能还未建立。此试验未经FDA明确证明可用于血液或血浆捐献者的检测。
注意：试验中需观察西尼罗河或是其他病毒中的IgM是否会与登革热试剂盒发生交叉反应，如可能发生了交叉反应，则视为警告状态
前言说明
登革热是一种急性病毒性疾病，它主要通过埃及伊蚊传播。登革热在临床上主要表现为：双相热、皮疹和造血抑制，还可表现出全身症状，如全身不适、关节痛、肌肉疼痛和头痛，有时还可能出现极为罕见的出血性高烧，并可能导致致命性的休克。登革热主要流行于热带和亚热带地区，大概每年会发生100,000,000例。据统计，每年大概会出现500到1000万例登革热病人，同时还会出现250000到500000例登革热出血热。在2002年，据报道，30多个拉丁美洲的国家出现10000000例登革热病人，并且大多数是登革热出血热（DHF）病人。之后在2003年到2005年，在印度的一些地方也广泛流行DHF。在美国，据报道，DHF病人在1996到2002年就增加了三倍。据报道说，登革热也在夏威夷和德克萨斯州的拉雷多爆发过。由于病毒的潜在传染性，一些病毒包括登革热都被列为CDD的A类潜在传染源。Inbios公司的登革热IgM抗体捕获法ELISA试剂盒很适合于CDC中使用，在感染后3到5内，原发性和继发性病人的体内都有可检测到的IgM抗体水平，而且这种抗体通常可以在人体内持续90天。
实验原理
DENV Detect IgM ELISA试剂盒是由一种酶联扩大的两步法免疫检测系统。在此实验中，将登革热阴性质控、阳性质控和未知浓度的血清样品用样品稀释液稀释，然后加入到包被了抗人IgM抗体的微孔中温育，之后分别加入登革热源性重组抗原DENVRA和正常细胞抗原（NCA）进行温育。温育并洗板后，用HRP标记的DEN特异性抗体处理。第二次温育并洗板后，加入TMB底物液进行温育。之后再加入酸性终止液，450nm处测OD值可确定底物反应的程度。当高于一定数值时（临界值），样品的吸光度值可确定样品中是否存在登革热抗体。
注意：阴性质控和弱阳性质控以内在质控形式提供，其目的是为了监测试剂盒成分的完整性。
试剂盒成分
登革热IgM ELISA试剂盒提供了足够做96个测试所需要的试剂。试剂盒成分如下：
登革热检测特定材料：
1）抗人IgM包被的包被板：带板盖的板架，包被有抗人IgM， 96孔，2-8℃下储存，有效期内稳定。
2）样品稀释液：1瓶，25ml，即用，含吐温20的Tris-HCl缓冲液，0.05%的Proclin防腐剂和添加剂，用于试验样品，阳性和阴性质控的稀释，2-8℃下储存，有效期内稳定
3）即用型的登革热重组性抗原（DENRA）：1瓶，3ml，含吐温20的Tris-HCl缓冲液，＜0.05%的Proclin防腐剂，抗生素（0.0025-0.004% G418 硫酸盐），登革热重组抗原和添加剂， 2-8℃下储存，有效期内稳定。
4）即用型正常细胞抗原（NCA）：1支，3ml，含吐温20的Tris-HCl缓冲液，＜0.05%的Proclin防腐剂，COS-1细胞的上清， 2-8℃下储存，有效期内稳定。
5）登革热阴性质控：1支，50ul阴性血清，登革热阴性质控可辅助监测试剂盒的完整性。2-8℃下储存，有效期内稳定。
6）登革热IgM阳性质控：1支，50ul含0.03%的proclin的阳性血清，登革热阳性质控可辅助监测试剂盒的完整性。2-8℃下储存，有效期内稳定。
7）10倍浓缩洗涤液：1瓶，120ml，含吐温20的10倍浓缩的磷酸缓冲盐，2-8℃下储存，有效期内稳定。
8）HRP标记的即用型酶联物，1瓶，6ml，HRP标记的黄热病毒活性单克隆抗体，含吐温20的Tris-HCl缓冲液，＜0.01%的硫柳汞防腐剂和添加剂，2-8℃下储存，有效期内稳定。
9）Enwash：1瓶，20ml，即用，含吐温20的磷酸缓冲盐， 2-8℃下储存，有效期内稳定
10） TMB底物液：1瓶，9ml液态底物液，即用，2-8℃下储存，有效期内稳定。注意：底物液必须始终储存于避光试剂瓶中。
11） 终止液：1瓶，内含6ml即用型的终止液，1N的硫酸，2-8℃下储存，有效期内稳定。注意：强酸，请戴保护手套、口罩和安全镜，按照安全条例处理所有的材料。
实验所需器材但试剂盒不提供
1）可在450nm处读数的酶标仪
2）生物学或高纯度水
3）真空泵
4）洗板机
5）37℃无CO2的孵箱
6）1-10ul的单道移液器，50-200ul的单道和多道移液器。
7）聚丙烯试管
8）Parafilm封口膜
9）计时器
10） 旋涡混合器
样品的采集与准备
1）此实验必须用血清来做。全血和血浆样本不能直接检测。
2）不要将不同批次的试剂混乱
3）不要加热热灭活的试验血清
4）实验前将所有试剂平衡至室温，温度的改变会对试验有影响
5）避免反复冻融样品血清
6）直接用干净的枪头从试剂瓶中移去试剂，不能转移，避免污染
7）不用的板条应立即放回至密封袋中保存
8）不要使用任何过期的试剂
9）避免试剂暴露受热或阳光直射
10） 有些试剂可能会产生沉淀，使用前一定要混匀
11） 洗涤过程不完整会对试验结果产生影响
12） 为了减少由于孵育时间的差异而引起的漂移，建议底物液和终止液加入的时间和速度要一致
13） 避免试剂中有微生物污染，尤其是酶联物
14） 每一次吸取试剂，标准品，质控品时都应用干净的枪头
