高效平台灌流培养基的开发策略
细胞灌流培养是蛋白药物连续流生产工艺的重要一环，而高效、低消耗的培养基则是细胞灌流培养工艺成败的关键因素。在fed-batch工艺占主导的今天，市面上缺乏灌流专用的平台培养基。生物制药企业在探索灌流工艺时，往往只能使用fed-batch基础培养基(或混合少量补料培养基)来作为灌流培养基使用，这些培养基没有经过专门的灌流营养优化，往往细胞密度和产量不会太高，而且灌流体积比较大，增加生产成本。
本文通过对EX-CELL® Advanced™ HD Perfusion Medium的产品开发过程进行案例分析，为生物制药企业的平台化灌流培养基开发工作提供思路借鉴。
最早的灌流培养基原型是利用默克CHO细胞基础培养库（Basal media diversity
panel）来生成。我们将库中不同培养基原型，进行DOE混料设计，生成多个新的混料配方（Mix）平行培养进行对比，并采集相关培养数据，以便进一步优化时进行MVA分析。根据试验结果，从中初步确定出两种最适灌流的混料培养基原型Mix G1 和 Mix P1；将此二种原型经过与多种富营养灌流培养基（basal medium enriched with Feed）反复进行反应器工艺平行对比，最终决定将混料培养基Mix P1作为灌流原型来进一步进行营养优化。
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图1 整体优化流程图 |
通过对上一轮实验数据的MVA分析，我们从中找出对灌流工艺关键参数有显著影响的营养成分共计11种。然后，采用DOE中心组合设计（CCD）的方法，对这11种成分的最佳浓度分别进行确定。（见下图2 ）
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图2 关键组分浓度优化。等高线图显示出11种关键组分中的两种（组分4，9）对蛋白产量的影响 |
最终，我们得到11种组分优化到最佳浓度的全新灌流培养基原型。
由于氨基酸在灌流细胞生长中的特殊重要性，我们又对这种新原型培养基单独进行了氨基酸优化：采用上清分析手段，对灌流中，细胞在生长和表达阶段的各氨基酸消耗速率分别进行测量，根据测量结果，我们按照20
pL/cell/day 的CSPR的模型来计算，对培养基中的氨基酸组分进一步强化调整（主要是增加了重要氨基酸的浓度）。氨基酸调整之后,
培养基的CSPR在几个测试的细胞株上均有显著降低，同时细胞单产（qp）也得以进一步提高。（见下图3）。
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图3 氨基酸浓度调整后的效果，在测试CHO-S细胞株上，CSPR从60 pL/cell/day降低到37 pL/cell/day，同时qp从原来的最高8.4pcd提高到最高11.7pcd。 |
接着对调整后原型的氨基酸消耗速率进行重新测试发现：随着CSPR的降低，细胞的氨基酸消耗速率也较之前发生了变化，降低CSPR，某些氨基酸却出现了过量现象（见下图4）。
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图4 在提高氨基酸浓度，降低CSPR之后，单细胞消耗氨基酸的速率也发生了改变（降低）。 |
这表明，培养基中氨基酸浓度及灌流速率等条件的改变，让细胞内的某些代谢通路发生了变化。所以，我们对部分过量的氨基酸进行了重新再平衡调整。
我们用不同细胞株对调整后的配方进行反应器灌流验证，以测试其广谱性。结果显示，该配方对不同类型细胞株灌流培养均具有优良效果。（见下图5）
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图5 在40 pL/cell/day的CSPR下灌流超过30天，细胞数维持在50*106 vc/mL，同时单位产量也维持稳定 |
小结：
在灌流培养基的开发过程中，统计学工具是必不可少的。如通过MVA分析定向找出关键组分，再通过DOE设计，对关键组分浓度进行快速优化，从而提升性能，这是灌流培养基开发的一个重要手段。另外，本案例显示，氨基酸浓度对灌流效果有相对重要的作用，通过氨基酸浓度的优化，较明显提升了培养效果。但在初次调整氨基酸浓度后，细胞的氨基酸代谢也随着出现了一定的变化（如重新测试后发现某些氨基酸有过量现象），说明细胞的氨基酸代谢之间有复杂的关联，对氨基酸的调整需要进行反复摸索，才可找到最佳的浓度组合。
