抗坏血酸含量测定（ 2,6 一二氯酚靛酚法）
一、目的
学习维生素 C 的生理功能和性质，掌握用 2 ， 6 一二氯酚靛酚法测定维生素 C 的原理和方法。
二、原理
维生素 C 是一种水溶性维生素，是人类营养中最重要的维生素之一，人体缺乏维生素 C 时会出现坏血病，因此它又被称为抗坏血酸。此外维生素 C 还具有预防和治疗感冒以及抑制致癌物质产生的作用。
维生素 C 的分布很广，尤其在水果（如弥猴桃、橘子、柠檬、山楂、袖子、草莓
等）和蔬菜（苋菜、芹菜、青椒、菠菜、黄瓜、番茄等）中的含量更为丰富。
不同栽培条件、不同成熟度和不同的加工贮藏方法，都可以影响水果、蔬菜的抗坏血酸含量。测定抗坏血酸含量是了解果蔬品质高低及其加工工艺成效的重要指标。
维生素 C 在金属铜和抗坏血酸氧化酶存在下极易氧化，因此，在用铜制品做食品时，维生素 C 易丢失。此外在碱性溶液中，维生素 C 也易被破坏，而在酸性溶液中比较稳定。利用它具有的还原性质可测定其含量。还原型抗坏血酸能被染料 2 ， 6- 二氯酚靛酚氧化为脱氢型，该染料在碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色，被还原后变为无色。因此用 2 ， 6 一二氯酚靛酚滴定含有维生素 C 的酸性溶液时，维生素 C 尚未全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色，当溶液中的抗坏血酸全部被氧化成脱氢抗坏血酸时，滴入的 2 ， 6 一二氯酚靛酚立即使溶液呈现淡红色。用这种染料滴定抗坏血酸至溶液呈淡红色为滴定终点，根据染料消耗量即可计算出样品中还原型抗坏血酸的含量。
三、仪器、试剂和材料
1 .仪器
（ 1 ）天平
（ 2 ）组织捣碎机
（ 3 ）微量滴定管（ 5ml)
（ 4 ）容量瓶（ 50ml)
（ 5 ）刻度吸管（ 5 ml, 10 ml )
（ 6 ）锥形瓶（ 100ml)
2 .试剂
（ 1 ） 1% 草酸溶液：草酸 1g 溶于 l00ml 蒸馏水中
（ 2 ） 2 ％草酸溶液：草酸 2g 溶于 l00ml 蒸馏水中
（ 3 ）坏血酸标准溶液（ 0. 1 mg/ ml) : 精确称取 l0mg 纯抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用）用 1 ％草酸溶液溶解并定容至 l00ml 。此溶液应贮存于棕色瓶中，最好临用前配制。
（ 4 ） 0 . 05 ％ 2,6 一二氯酚靛酚溶液：称取 500mg 2, 6- 二氯酚靛酚溶于 300ml 含 104 mg 碳酸氢钠（ A. R ）的热水中，冷却后用蒸馏水稀释至 1000ml ，滤去不溶物，贮存于棕色瓶中， 4''C 冷藏可稳定一周，临用前以标准抗坏血酸标定。
3 .材料
新鲜水果或蔬菜
四、操作步骤
1 .提取抗坏血酸
取新鲜水果或蔬菜 50g, 加入 50ml2 ％草酸溶液，用组织捣碎机打成匀浆。过滤取得滤液，滤饼可用少量 2 ％的草酸洗几次，合并滤液，记录滤液体积。
2 . 2 ， 6 一二氯酚靛酚溶液的标定
准确吸取 4 . Oml 抗坏血酸标准液（含 0 . 4g 抗坏血酸）于 l00ml 锥形瓶中，加 16ml 1 ％草酸溶液，用 2 ， 6 一二氯酚靛酚滴定至淡红色（ 15 秒内不褪色即为终点）。记录所用染料溶液的体积，计算出 l ml 染料溶液所能氧化抗坏血酸的量。
3 .样品滴定
准确吸取样品提取液两份，各 20ml ，分别放入两个 100ml 锥形瓶中，滴定方法同 2 中的操作，另取 20ml 1 ％草酸作空白对照滴定。
五、结果处理
取两份样品滴定所耗用染料体积的平均值，代入下式计算 100g 样品中还原型抗坏血酸的含量：
式中， V 1 为滴定样品所耗用的染料的平均毫升数；
V 2 为滴定空白对照所耗用的染料的平均毫升数；
V 为样品提取液的总体积；
V 3 为滴定时所取的样品提取液的毫升数；
M 为 l ml 染料所能氧化抗坏血酸的量（ mg ）（可由操作 2 计算得到）；
W 为待测样品的重量（ g ）。
六、注意事项
（ 1 ）用本法测定抗坏血酸含量虽简便易行，但有下述缺点：第一，本法只能测定还原型抗坏血酸，不能测出具有同样生理功能的氧化型抗坏血酸和结合型抗坏血酸。第二，样品中的色素经常干扰对终点的判断，虽可预先用自陶土脱色，或加入 2-3 ml 二氯乙烷，以二氯乙烷层变红为终点，但实际上仍难兔产生误差。
（ 2 ）用 2 ％草酸制备提取液，可有效地抑制抗坏血酸氧化酶，以免抗坏血酸变为氧化型而无法滴定，而 1 ％的草酸无此作用。
（ 3 ）如样品中有较多亚铁离子（ Fe 2+ ）时，也可使染料还原而影响测定，这时应改用 8 ％乙酸代替草酸制备样品提取液，此时 Fe 2 ＋ 不会很快与染料起作用。
（ 4 ）如样品浆状物泡沫过多，可加几滴辛醇或丁醇消泡。
（ 5 ）市售的 2 ， 6 一二氯酚靛酚质量不一，以标定 0.4mg 抗坏血酸消耗 2ml 左右的染料为宜，可根据标定结果调整染料溶液浓度。
（ 6 ）样品提取制备和滴定过程中，要避免阳光照射和与铜、铁器具接触，以免破坏抗坏血酸。
（ 7 ）滴定过程宜迅速，一般不超过 2min ，样品滴定消耗染料 1 - 4 ml 为宜，如超出此范围，应增加或减少样品提取液的用量。
（ 8 ）提取的浆状物如不易过滤，亦可进行离心收集上清液。
七、思考题
1 .维生素 C 具有什么性质和生理功能？
2. 为了在实验中得到准确的抗坏血酸含量应注意哪些问题？
参考文献
冯耀主编.维生素趣谈.重庆：四川科学技术出版社， 1999
李建伍等.生物化学实验原理和方法.北京：北京大学出版社， 2001
文树基主编.基础生物化学实验指导.西安：陕一西科学技术出版社， 1994
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