利用DeaLT技术揭示成人心肌细胞再生的来源（四）
策略4 Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1 通过NR1系统研究非肌细胞向肌细胞的转化
虽然利用广泛型启动子驱动的可诱导Cre或Dre可以有效标记大多数非肌细胞，但实际上标记效率并未达到100％。少数未标记的非肌细胞在损伤后在成体心脏中产生新的肌细胞也仍旧是有可能的，虽然可能性并不大，因为在谱系示踪期间的标记过程是完全随机的。为了达到100％的非肌细胞标记效率，利用NR报告基因小鼠（见下图），设计了第4种策略。
在这个系统中，ZsGreen标记小鼠所有的细胞，除了被tdTomato标记的新形成的肌细胞。Actb-Cre-loxP重组之后NR1小鼠中的所有细胞首先被标记为ZsGreen绿色荧光，只有新的肌细胞在形成时由于第二个Tnnt2-Dre-rox的重组而开启tdTomato红色荧光的标记（图5A）。绿色荧光蛋白在哺乳动物细胞中有12-24小时的半衰期，所以尽管肌细胞中的Dre-rox重组会导致tdTomato表达，但ZsGreen蛋白在降解前仍有稳定的标记时间。因此可以在非肌细胞向肌细胞转化期间检测到双阳性细胞。
图5. A
首先分析之前实验中的胚胎心脏（图5B）来测试这个系统。很容易在E8.5天发育的心脏流出道中检测到tdTomato+ZsGreen+肌细胞（箭头，图5C），这与以前的研究结果一致，表明第二心区祖细胞在这个阶段分化成心肌细胞。
然后，在MI造模28天期间每12小时间隔收集小鼠心脏样本进行分析（图5B）。对于ZsGreen、tdTomato和TNNI3免疫染色，结果显示在梗塞心肌中没有ZsGreen+tdTomato+肌细胞（图5D）。所有56个时间点的Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1小鼠心脏样本，超过6000个心脏切片中未检测到任何ZsGreen+tdTomato+肌细胞。类似地，分离心肌细胞进行流式细胞分析在ZsGreen+细胞中也没有发现肌细胞（图5E）。
相反，阳性对照实验中很容易在受损TA肌肉中检测到ZsGreen+tdTomato+肌细胞（图5F）。在Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1小鼠心脏切片中非肌细胞100%被ZsGreen标记（补充材料）。
图5.
综上所述，使用基于Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1的第4种谱系示踪策略的结果显示，非肌细胞向肌细胞的转化只在胚胎期而不在成体心脏中出现。
不同心脏细胞谱系对肌细胞的贡献
除了成体心脏中的心肌细胞外，还有多种具有已知分子标记的非肌细胞细胞谱系。对于这些不同的细胞群，用不同的Marker启动子驱动重组酶构建工具鼠，来追踪非肌细胞的细胞命运，如：
内心细胞：Npr3-CreER；
间充质干细胞或成纤维细胞：Sox9-CreER、Vim-CreER、Postn-CreER；
内皮细胞：Cdh5-CreER；
周细胞或平滑肌细胞：Myh11-CreER、Pdgfrb-CreER、NG2-CreER；
心外膜细胞：Wt1-CreER；
作为对照，用aMHC-MerCreMer来示踪心肌细胞。
对这10种工具鼠进行他莫昔芬诱导，两周后进行MI造模或假手术，并在心脏损伤4周后收集心脏组织样本（见下图B）。在这10个小鼠品系的心脏切片上的tdTomato和肌细胞标记TNNI3染色显示，在假手术或MI后除了来自已存在的心肌细胞外，并没有来自上述这些不同细胞谱系对肌细胞的贡献（下图C，D）。这些结果表明，所有这些非肌细胞都不参与向新的肌细胞转化，而aMHC-MerCreMer示踪数据显示，受损心肌中的所有心肌细胞均来源于已有的心肌细胞（下图C，D）。
图6. A-D
研究结论
因此，综合所有的实验结果，心肌再生中肌细胞生成肌细胞，而不存在非肌细胞向肌细胞的转化。
利用新建立的双同源重组技术系统的这项研究，由哪些临床意义呢？
表明假定的Sca1+，Bmi1+，Isl1+，Abcg2+或其他干细胞群体在成体阶段对于心脏再生并不具备生肌潜能。
心肌细胞是心脏再生的主要细胞来源。
这种新的遗传学系统提供了前所未有的策略，来研究假定的成体干细胞对组织修复和多器官系统再生的贡献。
