利用DeaLT技术揭示成人心肌细胞再生的来源（二）
Tnnt2-Dre; R26-iCre; IR1小鼠在E8.0天给予Dox诱导标记非肌细胞，发现在E8.5天时在其他组织中被标记上ZsGreen绿色荧光，心肌为红色荧光标记（图1E）。接下来收集E13.5天的心脏组织，发现dTomato、ZsGreen和TNNI3（肌细胞marker）的免疫染色显示E13.5天右心室中的大多数肌细胞是被ZsGreen绿色荧光标记的，说明在胚胎心脏发育早期，非心肌细胞具有分化形成心肌细胞的能力，这些非心胞可以贡献形成第二心区的心肌细胞（图1F），证明了新的示踪系统可以有效检测发育中的心脏非肌细胞向心肌细胞的转化。
图1. E-F
揭示非肌肉细胞转分化的 4 种策略
策略1 Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1 非肌细胞对成体心脏中的肌细胞没有贡献
使用Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠来同时追踪成体心脏中的心肌细胞和非心肌细胞。tdTomato、ZsGreen和TNNI3的免疫染色显示tdTomato+细胞是TNNI3+心肌细胞，而ZsGreen+细胞不是TNNI3+心肌细胞（图1G）。 分离Tnnt2-Dre; R26-iCre; IR1的心肌细胞进行体外观察也没有检测到ZsGreen+心肌细胞（图1H）。 因此，Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1系统用两种不同的荧光标记了肌细胞和非肌细胞（图1I）。
图1.G-I
非肌细胞在成体心脏中是否会分化成肌细胞呢？如果是，那么源自非肌细胞的新心肌细胞将是ZsGreen+的。而实验结果是：在Dox诱导后，对Tnnt2-Dre; R26-iCre; IR1小鼠进行结扎左前降支冠状动脉诱导MI造模（图2A）。心肌梗塞后，造成心肌细胞大量死亡，心脏功能受损，在损伤后2-4周，对心脏切片进行ZsGreen、tdTomato和TNNI3免疫染色，结果没有发现ZsGreen+TNNI3+的心肌细胞（图2B）。在5个心梗组织的600多个切片中，都没有检测到ZsGreen+tdTomato-心肌细胞。流式细胞分析（图2D）和荧光显微镜（图2E）也证实在Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠的MI造模后的心脏中也没有观察到ZsGreen+心肌细胞。RT-PCR结果也只有tdTomato的表达，没有ZsGreen的mRNA表达（n=5，图2F）。这些数据表明，非心肌细胞在成体心脏的心脏损伤后对肌细胞没有贡献。
图2. A-F
平行地，将骨骼肌损伤后骨骼肌中非肌细胞向肌细胞的细胞命运转化作为阳性对照。骨骼肌在稳态维持过程中，肌纤维细胞与非肌肉细胞发生融合，肌纤维细胞处于多核状态，因此在正常骨骼肌（假手术组）中，可以检测到tdTomato+ ZsGreen+肌细胞（图2G）。而当对Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠的胫骨前肌（TA肌）实施BaCl2损伤后，骨骼肌中肌纤维细胞大量死亡，TA肌损伤后可以检测到弱tdTomato荧光信号和强ZsGreen表达，表明在BaCl2造模后ZsGreen+细胞逐渐取代tdTomato+细胞（图2G）。与假手术组相比，在受损TA肌中可以检测到ZsGreen+tdTomato-肌细胞（箭头，图2G），说明非肌细胞重新形成肌细胞。
图2. G
综合上述结果，通过Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1（策略1）的双同源重组谱系示踪技术揭示了在胚胎心脏和成体骨骼肌中非肌细胞向肌细胞的转化，但在成体心脏中非肌细胞对肌细胞没有贡献。
策略2 Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3 反向Cre/Dre 系统在非肌细胞向肌细胞转化研究中标记两种细胞
设计第2个双同源重组谱系示踪系统用来验证非肌细胞向肌细胞的转化。该系统由Tnnt2-Cre（肌细胞中表达Cre）、他莫昔芬诱导型 R26-DreER 和IR3报告小鼠组成。利用IR3报告小鼠（见下图）可排它性地将非肌细胞标记上tdTomato红色荧光，将肌细胞特异性地标记上ZsGreen绿色荧光。
Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3小鼠就可以同时标记肌细胞（ZsGreen+）和非肌细胞（tdTomato+）（图3A）。
图3. A
胚胎E8.0天心脏中ZsGreen主要标记原始心管（图3B）。E8.0天给予他莫昔芬诱导，在E13.5天的右心室中发现tdTomato+非肌细胞对肌细胞有显著贡献（图3C）。心脏切片免疫染色也证实了此结果（图3D-F）。
同样，在成体心脏和骨骼肌中，通过MI和BaCl2造模来观察非心肌细胞的命运转化（图3G）。分离的心肌细胞的流式细胞分析（图3H）和荧光显微镜（图3I）分别结果也都显示没有tdTomato+心肌细胞。在形态上，这些tdTomato+细胞与ZsGreen+心肌细胞也明显不同（图3J）。
tdTomato和TNNI3免疫染色显示这些tdTomato+细胞在MI心脏的梗塞区、边界区和远端区均不会转化为TNNI3+心肌细胞（图3K）。来自5个Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3小鼠心脏的超过600个组织切片中均未检测到tdTomato+TNNI3+心肌细胞。RT-PCR结果也同样指出分离的心肌细胞只表达ZsGreen，不表达tdTomato（图3L）。
