利用DeaLT技术揭示成人心肌细胞再生的来源（一）
4月26日，国际学术期刊《Circulation》在线发表了中国科学院生物化学与细胞生物学研究所周斌研究组的研究成果“Genetic Lineage Tracing of Non-myocyte Population by Dual Recombinases”。该研究工作利用新建立的双同源重组技术（DeaLT）揭示了在胚胎心脏发育、成体心脏稳态维持及损伤修复、成体骨骼肌稳态维持和损伤修复过程中，非肌肉细胞分化形成肌肉细胞的潜能。
南模生物为该研究构建了超过15种小鼠模型。
Highlight
待解决问题:如何排它性地分别标记非肌肉细胞和心肌细胞？
解决方法:
利用DeaLT 双同源重组示踪报告基因系统（Dual-recombinase-activated lineage tracing）将 Dre-rox 重组系统与传统的 Cre-loxP 重组系统结合起来，交错的 loxP 和 rox 位点可以在 Cre-loxP 或 Dre-rox 重组后切除另一套重组系统，在可能引起重组酶异位表达的细胞中将另一套重组酶的识别位点切除掉，从而有效地阻止异位重组，使细胞排它性地被标记上 ZsGreen 或 tdTomato 荧光，增加谱系示踪结果的准确性。
根据 loxP 和 rox 的位置顺序不同，分为 IR 和 NR 两种报告基因系统。
方案一:IR
先用心肌细胞Marker的Dre使心肌细胞被标记上tdTomato红色荧光；
再用诱导型Cre，在药物诱导后表达Cre重组酶，将除了心肌细胞以外的所有非心肌细胞都永久标记上ZsGreen绿色荧光；
如果非肌细胞向肌细胞转化，那么由非肌细胞转化而成的新生心肌细胞将是ZsGreen绿色荧光标记的。所以只需要在心肌再生过程中寻找是否有带绿色荧光的心肌细胞即可。
方案二:NR
首先心肌细胞Marker的Dre和广泛型表达的Cre将细胞分为两类，一类是表达tdTomato红色荧光的肌细胞，一类是表达ZsGreen绿色荧光的非肌细胞；
如果发生非肌细胞向肌细胞的命运转化，那么在新肌细胞生成过程中，心肌细胞Marker的Dre会介导原来绿色荧光标记的细胞被标记上tdTomato红色荧光，因此会同时存在绿色和红色两种标记均阳性的新生肌细胞，产生黄色荧光信号。
研究背景
心脏作为脊椎动物最重要的器官之一，主要功能是为血液流动提供动力。心脏发生心肌梗塞后造成心肌细胞大量死亡，心脏功能受到影响。成体心脏是否存在心肌干细胞一直存在争论，之前的研究利用传统的遗传谱系示踪技术认为在成体心脏中存在心肌干细胞，例如Kit+心肌干细胞、Bmi1+心肌干细胞、Scal1+心肌干细胞、Islet+心肌干细胞等，但由于这些心肌干细胞的分子标记本身就表达于部分心肌细胞中，因此这些假设的心肌干细胞向心肌细胞的分化潜能仍受到质疑。
在最新的这篇研究成果中，研究人员利用双同源重组技术同时对肌肉细胞和非肌肉细胞进行谱系示踪，系统揭示非肌肉细胞向肌肉细胞分化的潜能.
标记非肌肉细胞的新示踪技术
为了明确非肌肉细胞中是否存在假定的心脏干细胞CSC，研究人员设计了标记所有非肌肉细胞谱系的新系统。利用DeaLT-IR1报告基因小鼠（见下图），交错的loxP和rox位点可以在Cre-loxP或Dre-rox重组后切除另一套重组系统，从而使细胞排它性地被标记上ZsGreen或tdTomato荧光。
如何利用该系统来分别标记肌细胞和非肌细胞呢？需要将 Tnnt2-Dre（Tnnt2是心肌细胞Marker）、R26-iCre（由R26-rtTA与TRECre交配获得，可在强力霉素 Dox 诱导下表达 Cre）和 IR1报告基因小鼠3种小鼠交配在一起，获得 Tnnt2-Dre; R26-iCre; IR1小鼠：Tnnt2-Dre首先标记表达Dre的肌细胞；并且在强力霉素（Dox）处理后，R26-iCre 标记除肌细胞外的所有细胞（图1A,B）。该双同源重组系统中用tdTomato来标记肌细胞、用ZsGreen来标记非肌细胞。
图1. A-B
首先，用这套系统研究在胚胎心脏中非肌细胞向肌细胞的转化。在胚胎心脏发育早期，Isl1+的心肌干细胞可以贡献第二心区的心肌细胞，例如，心脏的流出道，右心室部分的心肌细胞，以及左心室和心房非常少量的心肌细胞均来自于Isl1+的心肌干细胞（图1C）。Isl1-CreER;R26-tdTomato小鼠在E8.0天给予他莫昔芬诱导，在E13.5天右心室被标记上红色荧光（图1D）。
图1. C-D
