小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养（四）
3. BMDC的完全成熟
注：步骤2中获得的BMDC并非完全成熟的DC,若想得到完成成熟的DC,还需LPS,CD40L或TNF-a等的诱导。
3.1 步骤2.4或2.9中获得的BMDC以1200rpm离心5 min,弃上清；
3.2 用含重组小鼠GM-CSF（20ng/ml）和IL-4（10ng/ml）的RPMI完全培养液重悬沉淀，计数后调整细胞浓度为1x106/ml；
3.3 加入24孔培养板中，并加入成熟诱导剂，如TNF-α（250U/ml），LPS（1μg/ml）、或 CD40L（1μg/ml）等；3.437℃，5% CO2培养箱培养2天；
3.5 收集悬浮细胞及疏松贴壁生长的细胞即为成熟树突状细胞。
【BMDC大量制备法】-Son法[9]
背景：
1. 该法可在7天内获得30-40x106个DC/小鼠，是Inaba 经典方法的7-10 倍。DC经14.5%甲泛葡胺（Metrizamide）梯度离心后，纯
度（即 CD11c+/I-Ab+ 细胞）可达85-95%.
2. 该法获得的DC的内吞能力弱于Inaba 经典方法，但分泌的IL-12p70量相似；
3. 该法获得的DC在混合淋巴细胞反应中比Inaba经典方法呈现更强的刺激能力；
4. 该法获得的DC能引起更强的特异性T细胞反应；
5. 以上结果提示，该法比经典方法能获得更多、更成熟的BMDC。
培养步骤：
1. 小鼠骨髓细胞的获得
见Inaba法（改良）中的相应步骤。
2. BMDC 的大量制备
2.1 步骤1中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含 10% FBS的RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为 2 x 105/ml;
2.2 铺至6孔培养板内，每孔5 ml 细胞，同时加入重组小鼠GM-CSF（1000 U/ml）和IL-4（1000 U/ml），37℃，5% CO2 培养箱培养；
注：1）作者试探了125 U/ml、250 U/ml、500 U/ml 和 1000U/ml四个细胞因子浓度，发现浓度越低，BMDC细胞产量和成熟度越低，所以仍建议用1000 U/ml。
2） 笔者认为，1000 U/ml 是一个非常高的浓度，会导致培养成本过高。
2.3
在培养的第4天，向培养体系中补充重组小鼠 GM-CSF（1000 U/ml）和 IL-4（1000 U/ml）；
注：向培养体系中直接补充细胞因子而不换液的目的是避免出现任何细胞损失，以获得最大量的DC.笔者认为，培养过程中必然会出现培养液发黄
的情况，如果不换液而只是添加细胞因子，细胞很快会因为营养不够而死亡。所以笔者建议在第4天和第7天时将培养液半量或3/4量吸出，离心后加入含足量GM-CSF和IL-4的新鲜培养液重悬细胞沉淀，然后再将
细胞放回至原板。
2.4 培养的第7天收集 DC，用2-4ml RPMI 1640完全培养液重悬，加至等体积的14.5%（w/v）甲泛葡胺上，1200 x g室温离心20 min。
注：此时的DC为不完全成熟的BMDC,要想进一步成熟，请跳至步骤 3。
2.5 收集中间层，并用RPMI 1640完全培养液洗3次备用。
3. BMDC 的完全成熟
3.1 步骤2.4中收集的 BMDC,重新铺板，并向培养体系中加入重组小鼠GM-CSF（1000 U/ml）和 IL-4（1000 U/ml），以及 LPS（1-10μg/ml）
3.2 37℃，5% CO2培养箱培养 2 天，获得成熟的BMDC。
【BMDC大量制备法】-Lutz法[8]
¾ 背景：
1. Lutz法与Son法相似，均可大量制备BMDC，但与Son 法相比，Lutz法更为广泛地被采用，从以下两个方面可以得到印证：
1） 虽然Lutz法比Son法早发表3年（分别是1999年和2002年），但截至2015年12月，PubMed中已有633篇文献中引用Lutz法，而仅有24篇文献引用 Son法。
2）
在美国著名的学术社交平台：www.researchgate.net 上有一个交流帖，问：Does anyone have a protocol
for generating dendritic cells from mouse bone marrow using GM-CSF?
回答者中大多数推荐和盛赞Lutz的BMDC培养法。
2. 该法可获得更多的 BMDC,达1-3 x 108 个/小鼠，而且纯度可达 90-95%；
3. 该法比Son法使用的细胞因子浓度低得多，仅为200 U/ml，而且培养的第8天到 第10天降为30-100 U/ml，这样可以大幅节约试剂成本；
4.
该法与Inaba经典方法和Son法的最大不同是使用细菌培养皿（Petri
dish）而非细胞培养板来培养骨髓细胞。Inaba的解释是细菌培养皿不容易使骨髓中的巨噬
细胞贴壁，从而抑制巨噬细胞的发育，进而避免巨噬细胞对DC成熟的抑制作用， 这可能是该法能够以较低铺板密度获得大量 BMDC 的主要原因。
5. 但该法的培养时间较长，需要10-12天，一方面是为了获得更多的BMDC，另一 方面，大多数粒细胞和淋巴细胞很难存活这么长时间，因此可提高最终获得的BMDC的纯度；
6. 该法仅用GM-CSF进行诱导培养，得到的BMDC中未成熟和成熟DC均有，若 要进一步提高成熟度，需用LPS或TNF-α再诱导1-2 天，其中成熟DC细胞的含量将达到50-70%。
