风湿病的临床实践和实验室检查
一、定义
传统认为抗细胞核内成分的抗体称为抗核抗体(Autoantibody to Nuclear Antigen, ANA)，这一概念强调了细胞核的重要性，因为细胞核内有DNA、RNA、碱性组蛋白、非组蛋白、磷脂及各种蛋白酶等复杂的化学组成，决定了ANA存在不同的成分，因此，构成了抗核抗体谱(ANAs)。随着免疫荧光技术的改进，先进的免疫学技术的应用和分子生物学的发展，目前对ANA的理解已不再局限于核成分，而是指抗核酸(nucleic acid)和核蛋白(nucleoprotein)抗体的总称。故现在对ANA靶抗原的理解已从传统的细胞核扩大到整个细胞。ANA在许多风湿性疾病，如系统性红斑狼疮、硬皮病、干燥综合征、类风湿关节炎等均可阳性，因此是诊断弥漫性结缔组织病的筛选抗体。健康老年人、感染性疾病和服用某些药物(普鲁卡因酰胺、肼苯哒嗪、苯妥英钠、异烟肼等)的患者均可有ANA阳性。
1954年Hargrave发现LE细胞奠定了当今ANAs的基础。已知LE因子即是ANA，它是一种抗DNA-组蛋白(DNP)复合物的抗体，目前已采用简易和迅速的抗DNP抗体测定取代LE细胞的检查。
二、测定原理和方法
常规检测ANA的方法是以鼠肝和鼠肾为底物的间接免疫荧光法。由于某些抗原如SSA/RO、Jo-1、rRNP等在细胞浆内比核内含量多，因此，鼠肝或鼠肾作底物检测常呈阴性反应，为弥补这一不足，以核质丰富的Hep-2细胞(人喉癌上皮细胞)为底物提高了ANA检测的阳性率(≥1：40为阳性)。对于ANA阳性的标本，应排除实验过程中血清洗脱不尽或标有荧光素的抗人免疫球蛋白浓度过高而造成的假阳性。必须强调指出，待测血清标本一定要稀释，因为低滴度的ANA可在感染性疾病、肿瘤及正常人中出现。未加稀释的正常人血清可有1/3的呈阳性ANA反应，但其滴度较低。ANA作为自身免疫性结缔组织病的筛选试验必须强调高滴度。对于ANA阴性的标本，要考虑是否有底物保存不当或操作过程中造成的误差，抑或药物治疗后病情缓解所致。
ANAS的荧光染色型别有五种。
(1)均质型：核质染色均匀一致，此型与抗组蛋白抗体和抗DNA抗体有关；
(2)斑点型：核质染色呈斑点状，核膜存在，此型多与可溶性核抗原(ENA)抗体有关；
(3)核仁型：仅核仁着染荧光，与4—6SRNA抗体相关，在硬皮病中较多见；
(4)核周(核膜)型：荧光包绕在核膜周围，多与抗双链DNA抗体有关；
(5)着丝点型：处于分裂时相的Hep-2细胞为底物可出现依着丝点散在排列的特殊点状圆形，与斑点型区别的重要之处在于前者核膜已消失，主要与雷诺现象有相关性。荧光染色核型可随血清稀释的改变而发生改变，如均质型的ANA在血清稀释后可出现斑点型和核周型。对于ANA阳性的标本，应采用对流电泳法、免疫双扩散法、酶联免疫吸附法(ELISA)或放射免疫法、免疫印迹法等识别出确切类型，因不同类型的ANA有其不同的临床意义。 三、ANAS的分类
根据细胞内各分子的理化特性和分布部位，将ANAs分为四大类，简述如下：
(一)抗DNA抗体
又可分为单链(变性)和双链(天然)DNA抗体。抗单链DNA(SSDNA)抗体在多种疾病中及正常人血清中存在，因此无特异性，临床上价值不大。抗双链DNA(dsDNA)抗体对诊断系统性红斑狼疮(SLE)有较高的特异性，尤其在活动期SLE病人血清中有滴度较高的抗dsDNA抗体，随着疾病活动的控制，抗dsDNA抗体滴度可以下降或消失。低滴度的抗dsDNA抗体也可在多种疾病甚至正常人中出现。放射免疫法(Farr)、以短膜虫或马疫锥虫为底物的间接免疫荧光法(IF-CT或IF-TE)、血凝法(HA)和酶联免疫吸附法(ELISA)均可用以抗dsDNA的检测，但不论那种方法均应测出滴度。Farr法敏感，但不如IF-CT或IF-TE法特异，抗dsDNA抗体用Farr法检测，其结合率≥20%或用IF-CT法≥1：5方可判为阳性。抗dsDNA抗体除帮助诊断SLE外，尚可判断SLE的活动性及作为治疗的估价，已证明抗dsDNA抗体与DNA结合成为免疫复合物在肾小球基底膜沉积，或抗dsDNA抗体直接作用于肾小球抗原而造成SLE病人的肾损害。
(二)抗组蛋白抗体
组蛋白是染色质的基本结构核小体的重要组成部分。H1在DNA双螺旋之外，DNA双螺旋包绕于由H3、H2A、H2B、H4组成的核心。抗组蛋白抗体采用ELISA检测，可以在多种自身免疫性结缔组织病中出现。药物引起的狼疮其抗组蛋白抗体达95%。我们用ELISA对109例SLE、117例类风湿关节炎(RA)、46例干燥综合征(SS)、22例硬皮病(SD)、25例其他结缔组织病、29例非结缔组织病及长期服用他巴唑22例、苯妥英钠55例和异烟肼198例病人，进行了血清抗组蛋白抗体测定，其阳性率分别为50%、23%、33%、27%、36%、10%、0%、18%和53%。抗组蛋白抗体的滴度在SLE病人和服用异烟肼的病人中最高。进一步分析后发现，在SLE病人中主要以抗H2B、抗H2A-2B和抗H1为主且主要是IgG型抗体。而在服用异烟肼的病人中，抗组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4的滴度基本一致，且不以IgG型抗体为主。在服用异烟肼具有抗组蛋白阳性的病人，临床上并没有出现狼疮的临床症状。不同药物所致的抗组蛋白的亚单位抗体不同，如服用肼苯哒嗪的抗组蛋白抗体主要是抗H3和抗H4抗体，而由普鲁卡因酰胺所致的抗组蛋白抗体主要为抗H2A-2B复合物抗体。
(三)抗非组蛋白抗体
1.抗ENA(Extractable Nuclear Antigen)抗体：
此组抗原不含组蛋白，可以溶于盐水而被提取。此类抗体与疾病的严重程度或其活动性无明显相关。
(1) 抗nRNP(nuclear RNP)：以抗核内的核糖核蛋白而得名。临床上应用较多的是u1RNP抗体。通常又把nRNP称之为u1RNP。u1RNP由u1RNA和9种不同的蛋白质组成。具有抗原性蛋白的分子量有70KD、30KD(A)和22KD(C)。60%抗u1RNP可与B、B，多肽出现微弱的反应。抗u1RNP抗体在混合性结缔组织病(Mixed connective tissue diseases，MCTD)中几乎均为阳性，且其滴度很高；在其他结缔组织病中阳性率低且滴度低；它是区分结缔组织病和非结缔组织病的有力指标。抗u1RNP抗体阳性的病人，常有双手肿胀、雷诺现象、肌炎和指(趾)端硬化。有人认为抗u1RNP抗体阳性的SLE病人，如抗dsDNA抗体阴性，则肾病发生率较低；如若与抗dsDNA、抗Sm抗体同时存在，则发生狼疮性肾炎的可能性较大。
(2)
抗Sm抗体：以病人名字(Smith)命名。已知Sm是核内小核糖体蛋白(SuRNP)，含有除u3RNA外的所有u族RNA。其抗原决定簇主要在与u1、u2、u4-u6RNA连接的B和D蛋白多肽上，已知蛋白多肽的分子量B(29KD)、B，(28KD)、D(16KD)。抗Sm抗体的蛋白多肽较高特异性的为B和D带。国际上通常用对流电泳和免疫双扩散法检测抗Sm抗体，其阳性率在SLE中为30%左右，抗Sm抗体对早期、不典型的SLE或经治疗缓解后SLE回顾性诊断有很大帮助。
必须强调指出，Sm和nRNP是同一分子复合物(RNA-蛋白颗粒)中的不同抗原位点，其中的RNA富含尿嘧啶核苷(u1、u2、u4-u6)，如前述，Sm含有u1、u2和u4-u6，而nRNP(u1RNP)仅含u1RNA。从理论上讲，测得抗Sm抗体的同时，也应测得抗u1RNP；而测得抗u1RNP则抗Sm抗体亦可为阴性。我院开展临床检测20余年来，用电泳和双扩散法，尚未有抗Sm抗体阳性而抗u1RNP抗体阴性，也即抗Sm抗体阳性均伴有抗u1RNP抗体，但抗u1RNP抗体可以单独存在。
抗u2RNP抗体在系统性硬化症伴多发性肌炎的重叠综合征中阳性频率较高。银屑病及雷诺现象的病人也可呈阳性。
抗u3RNP抗体常与系统性硬化相关，且常伴有原发性肺动脉高压、骨骼肌和小肠受累。
(3) 抗SSA/RO抗体：由于该抗体与干燥综合征(Sjogren syndrome，SS)相关，故取名为SSA，也有人取名于最早检测到的病人名字Ro。SSA与Ro的抗原性、生化特点一致。SSA/Ro是含有Y-YRNA的蛋白质，更多存在于胞浆内。在以鼠肝为底物的ANA检测中，抗SSA抗体常呈阴性反应，而以Hep-2细胞为底物，则ANA为阳性。
(4) 抗SSB/La、Ha抗体：另外还有一种与干燥综合征相关的抗体称SSB，也有人将SSB抗体以病人名字La或Ha命名。SSB/La、Ha是RNA多聚酶转录中的小RNA磷酸蛋白质。
临床上常规采用对流电泳和免疫双扩散法检测抗SSA和抗SSB抗体。近年来发展的免疫印迹检测中的抗SSA与分子量为60KD和52KD的两条蛋白多肽发生反应。有人认为60KD的多肽在SLE中较SS更为多见。抗SSB与分子量为48KD、47KD、45KD的三条蛋白多肽反应，但48KD更具有特异性。如上所述抗SSA/Ro和抗SSB/La、Ha与SS有关。在原发性SS病人中，抗SSA/Ro和抗SSB/La、Ha阳性率分别为60%和40%，但在其他结缔组织病人中，这两种抗体亦可存在。以Wil-2细胞提取抗原，在原发SS、SLE、RA、SD、PM/DM和非结缔组织病中，抗SSA/Ro阳性率分别为75%、39%、20%、19%、25%和0%；而抗SSB/La、Ha阳性率分别为59%、10%、5%、2%、5%和0%。抗SSB抗体较抗SSA抗体诊断干燥综合征更为特异。在临床上所谓ANA阴性的SLE病人，大部分有抗SSA抗体。进一步的研究还表明，抗SSA和抗SSB抗体阳性可造成新生儿狼疮及婴儿心脏传导阻滞等先天性心脏病。抗SSA和抗SSB抗体常与血管炎、淋巴结肿大、白细胞减少、光过敏、皮损、紫癜等临床症状相关。
(5) 抗rRNP抗体：rRNP(ribosome RNP)与nRNP抗原性不同，它是主要在胞浆中的一种磷酸蛋白。免疫印迹法测得抗rRNP抗体主要有38KD、16KD、15KD三条蛋白多肽。国外报道近一半的SLE病人有抗rRNP抗体。我们检测发现，抗rRNP抗体在SLE、RA、PM/DM、SS、MCTD和SD中的阳性率分别为24%、1.7%、9%、4%、0%、和0%。我们以免疫双扩散法测得的24例抗rRNP阳性的SLE病人中37.5%(9/24)伴有中枢神经症状，而在抗rRNP阴性SLE病人中，仅12.5%(2/16)伴又中枢神经症状，两者相比有显著性差异。我们还发现，抗rRNP抗体不会随病情的缓解立即消失，可持续1--2年后才转阴。对于仅有rRNP抗体阳性，ANA阴性的病人，应密切随访，若干年后可能发展为典型的SLE。
(6) 抗PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen)抗体：抗增殖细胞的核抗原抗体。PCNA是分子量为35KD的DNA聚合酶δ副蛋白。用免疫双扩散法测得在SLE病人中阳性率为3-5%，其他结缔组织病人中常为阴性。
(7) 抗Ku抗体：以日本病人的名字命名。Ku是与DNA直接结合的70KD和80KD的蛋白二聚体。免疫双扩散检测PM/SD重叠综合征的病人其阳性率为3%。ELISA测得该抗体在SLE中为39%，MCTD中为55%，40%的SD病人有低滴度的抗Ku抗体。
(8) 抗Scl-70抗体：因该抗体主要在SD(Scleroderma)中出现，且其抗原分子量为70KD而得名。但Scl-70实为分子量为100KD的DNA拓扑异构酶1(TopolsomeraseⅠ)的降解产物。SD中抗Scl-70阳性率40%左右，常把抗Scl-70抗体视为SD的标记抗体。有人发现抗Scl-70阳性SD病人，发生肺间质变的危险性较抗Scl-70阴性的SD病人增加10多倍。抗Scl-70抗体似与心、肾受累无关。
(9) 抗Jo-1抗体：以病人名字John而得名。Jo-1抗原是分子量为50KD的组氨酰tRNA合成酶，以免疫双扩散法检测25%的PM/DM病人有此抗体。在合并肺间质变的PM/DM病人中，抗Jo-1抗体高达60%，临床上还发现以急性发热、对称性关节炎、“技工手”、雷诺现象、肌炎并肺间质变的病人，抗Jo-1抗体常呈阳性，有人称之为“抗Jo-1抗体综合征”。抗Jo-1抗体常被视为PM/DM的标记抗体。
(10) 抗PM-1(PM-Scl)抗体：按疾病多发性肌炎(PM)而命名。该抗体主要在PM和SD相叠的病人中，其抗原为分子量110KD-120KD不等的多种蛋白，在PM/DM阳性率为10%—50%不等。在PM/SD重叠且伴有肾炎的病人中，阳性率高达87%。2.抗着丝点抗体：
用Hep-2细胞作底物，在非分裂期细胞，核质内为数不多的散在斑点与染色体的着丝粒区一致；在有丝分裂期，在线状排列的浓缩染色体中板上，可见到与浓缩染色体相应排列的丝粒点，该抗原是染色体粒区的17KD、80KD、和14KD蛋白，80%SD的亚型CREST(软组织钙化、雷诺现象、食道功能障碍、指端硬化、毛细血管扩张)综合征有此抗体。但我国材料表明，抗着丝点抗体并非CREST综合征特有，在弥漫性硬皮病患者或一些仅有雷诺现象的病人亦呈阳性，且较长时期追随并不能诊为CREST。另外在某些肝病(原发性胆汁性肝硬化等)、干燥综合征患者也可阳性。与国外资料不同，我们发现5%的弥漫性硬皮病患者同时具备抗Scl-70和抗着丝点抗体。
(四)抗核仁抗体
主要是指核仁内的RNA多聚酶，原纤维和To/Th抗原的抗体。抗核仁抗体主要与SD相关，用间接免疫荧光法可以发现核仁呈斑点、斑块或均质型染色。RNA多聚酶是分子量为210KD-211KD不等的多种蛋白，在SD中阳性率为4%；原纤维是分子量为34KD蛋白，为u3RNP的组成部分，在SD中阳性率为8%；To/Th是与7-2和8-2RNA形成复合物的40KD蛋白，该抗体在SD中小于3%。
