24cm IPG胶条二维电泳
实验概要
本实验应用二维电泳(two-dimensional gel electrophoresis，2DE)技术对提取的2D大鼠视网膜组织蛋白进行分离，获得了分辫率高和重复性好的2DE图像，建立了2DE分离技术的平台，为进一步研究莫定了基础。
实验步骤
1. 清洗器具用品：清洗所有的干胶条套件，包括胶条槽、盖片、托盘等。用Ettan IPGphor胶条槽清洗剂(Amersham Biosciences.)，并用大量去离子水冲洗，自然干燥备用。
2. 第一向等电聚焦电泳
1) 加样和IPG干胶条再水化：采用样品加在再水化液中方法进行加样。24cm IPG胶条(PH3 -10Non-line )。银染蛋白质上样量为40ug-50ug。根据上样量计算出样品上样的体积，加入样品水化液，使总体积为450ul，充分混匀。将液体平铺在胶槽内。取24cmIPG干胶条，从酸性端(尖端)一侧剥去胶条保护膜，胶面向下，先将阳性端(尖端)放入胶条内，慢慢下压胶条，避免产生气泡，最后放下胶条平端(阴极端)，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条两段和胶槽两端电极接触。在胶条上覆盖植物油，盖上盖子。
采用再水化同时上样的方法。低电压再水化的步骤编为利用Ettan IPGphor进行电泳的第一步，再水化时间为12小时。
2) 设置等电聚焦电泳条件：在Ettan IPGphor等电聚焦设备上采用再水化同时上样方法进行IPG等电聚焦。再水化和等电聚焦温度均为20℃，电流最强上限为每胶条50uA，再水化时间12h。
第一步再水化： 30V 6h
60V 6h
第二步： 500V 1h
第三步： 1000V 1h
第四步： 8000V 20h
结束：8000V， 64，000Vh。
3. IPG胶条平衡：两步平衡
第一步平衡：IPG胶条分别放入试管内，支持膜贴着管壁。加入10 ml含有DTT的平衡液。每10 ml平衡缓冲液中加入100 mg DTT，用盖子盖住试管或用封口膜封住试管，将其平放在摇床上，平衡15分钟。
第二步平衡：用含碘乙酞胺的平衡溶液(不含DDT)进行第二步平衡，在每10mlSDS平衡缓冲液中加入250 mg碘乙酰胺。
4. SDS-PAGE
1) 配胶：12.5%均一SDS聚丙烯酰胺凝胶，单块胶总量100 ml。
2) 灌胶：将配制好的胶液灌入模具中，至顶部3 cm左右。胶面上加入水饱和正丁醇20ul/块。2小时后，可以使用。观察凝胶，确保聚合反应均匀完全，凝胶内部没有气泡，并且凝胶的顶部表面平展。倒掉覆盖在凝胶上的溶液，用凝胶储存液冲洗凝胶表面。
3) 放置IPG胶条和加入分子量标准蛋白：将平衡后的胶条，放置于凝胶的顶部。加入分子量标准蛋白：将上样滤纸片剪成约1 X 2 mm2，放在玻璃板上，分子量标准蛋白与等体积的1%琼脂糖混匀，溶液加到上样滤纸片上。用镊子将上样滤纸片放置在IPG胶条末端一侧(右侧)的凝胶表面。
4) 琼脂糖封胶液固定IPG胶条： 0.5%琼脂糖水浴加温，在100℃条件下，使每管琼脂糖封胶液融化大概需要10分钟。当封胶液达到60℃时(用手能拿住)，缓慢地吸取足够量的密封液(每块凝胶需要1-1.5 ml)将IPG胶条完全覆盖。不要产生气泡。
5) 电泳条件：起始设置2 W/gel，1 h；5 W/gel，1 h；然后以恒定功率15 W/gel，4-5 h，当澳酚蓝指示条带达胶面底端时结束电泳。
5. 银染及结果分析：试剂配制如下：
取出凝胶板，剥胶，置于存有染液的托盘内在摇床上轻轻摇动。采用银染方法。
1) 固定：凝胶置于固定液中(乙醇200 ml、乙酸50 ml、加去离子水至500 ml ) 1小时；
2) 敏化：换敏化液(硫代硫酸钠1 g，醋酸钠34 g、去离子水至350ml、乙纯150ml)敏化30 min；
3) 水洗：倒出敏化液，用去离子水洗3次，每次5分钟；
4) 银染：置于银染液(硝酸银溶液1.25 g，加去离子水至500mI)中染色20分钟；
5) 漂洗：用去离子水500 ml漂洗一次，2分钟；
6) 显色：加显色液(无水碳酸钠12.5 g加去离子水至500 ml，临用前加甲醛200ul)，至蛋白点完全清晰显现，背景干净时为止。约5-10分钟；
7) 终止二倒出显色液，立即换终止液(乙二胺四乙酸二钠7.3 g，加去离子水至500 ml ) 10 min，终止显色；
8) 换水：去离子水500 ml飘洗2次，每次10分钟；
9) 保存：在去离子水中保存留待扫描及图像分析。
6. 凝胶扫描及结果分析：用UMAX扫描仪对凝胶进行扫描，并用Image Master 2D 5.0分析软件对图像进行分析。
注意事项
1. 戴手套清洗，不用手接触胶条槽。胶条槽在使用前必须完全干燥。
2. 将所有凝胶模具(电泳槽、玻璃板、厚玻璃板、塑料薄片)、试管、染色用托盘和量筒用去污剂软刷刷洗(用力擦，把胶渍擦干净)，避免其他蛋白质污染和以往实验残留物。去离子水反复冲洗两遍，自然干燥。
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