双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)-4
由于合成载体两性电解质（synthetic carrier ampholyte SCA）是通过复杂的合成过程得到的，其重复性很难控制，由此不同批次之间会存在很大的变化，同一蛋白质在不同批
图-1. 等电聚焦的“聚焦效应”
次等电聚焦中所出现的位置有所偏差，这样作为双向电泳中的一向时就限制了蛋白质分离的重复性。另外，SCA分子量相对较小，难以在IEF胶内固定，再等电聚焦过程中由于水合正离子引起电渗流（electroendosmosis）将致使SCA分子向负极迁移（负极漂移），结果使pH值的不稳定性增加。
基于以上的种种因素，20世纪80年代建立起一种新型的等电计较技术—固相pH梯度等电聚焦。固相pH梯度等电聚焦（Immobilized pH
gradients isoelectric focusing,
IPGIEF）是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时，在滴定终点附近形成pH梯度，然后将其共价键合在介质上，成为凝胶介质的一部分，从而形成固定的，不随环境电场等条件变化的pH梯度。与传统的载体两性电解质等电聚焦相比，具有更高的分辨率和可重复性，更好的pH值的稳定性，更大的上样量等优点。分辨率可达0.001pH，是目前分辨率最高的电泳方式，可用于分析和制备等电点极其相近的蛋白质和多肽，是目前唯一可以分析只有一个氨基酸差异的两种蛋白质的的电泳方法。
固相pH梯度等电聚焦技术的突破要归功于Immobilines试剂（Amersham Pharmacia Biotech,
APB）的基础上开发的固相pH梯度（IPG）技术。Immobilines（固相试剂）是一系列性质稳定的具有弱酸弱碱性质的丙烯酰胺衍生物，与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有类的
聚合行为。每个分子都有一个单一的酸性或碱性缓冲基团与丙烯酰胺单连，其结构式为：
其中R代表羧基或第三氨基。分子一端的双键可以在聚合过程中共价键合镶嵌到聚丙烯酰胺介质中。所以它是固相的，即使是在电场中也不会漂移。分子另一端的R基团为弱酸或弱碱性的缓冲基团，利用缓冲体系滴定终点附近一段pH范围就可形成近似线性的分布在pH3～10范围的缓冲体系。见图-2。
在固相pH梯度的发展中，为了改善结果，简化操作，把IPG胶灌到塑料支持膜上形成商品化的固定干胶条，即IPG胶条。固定干胶条（immobiline
PHgradients,IPG）的概念：胶条由基质和聚丙稀酰胺形成一个整体，PH梯度的产生是由酸性和碱性基团与聚丙稀酰胺以梯度式共价键连接而形成。即使在电场中，它也是“固相”的。
图-2固相pH梯度聚丙烯酰胺凝胶基质结合缓冲基团
2． [操作步骤]
1. 加样品水化用水化液溶解样品，一般18cm的胶条加水化液后的终体积是350μl。蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。
2. 将溶解好的样品加入放入标准型胶条槽中。
3. 从酸性端（尖端）一侧剥去IPG胶条的保护膜，胶面朝下，先将IPG胶条尖端（阳性端）朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢压下胶条，并前后移动，避免产生气泡，最后放下IPG胶条平端（阴极），使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。
4. IPG胶条上覆盖适量 矿物油，盖上盖子。
5. 将标准型胶条槽的尖端背面电极与IPGphor仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与仪器的阴极平台接触。
6. 设置PGphor仪器运行参数：胶条水化的电压，温度和时间：等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。
7. 暂时不进行第二向的IPG胶条可夹在两层塑料薄膜中于—80℃保存几个月。
3．[试剂准备]
1.水化液（8M尿素，2%CHAPS，15mM DTT和0.5%IPG缓冲液）:
水化液需当天新鲜配制(可配成储液分装-20度保存，但不可反复冻融)。
2. IPG胶条
3. 矿物油
五 、 IPG胶条的平衡
1．[基本原理]
第一向电泳后蛋白质得到了初步分离，凝胶条中所含的蛋白质区带，是第二向电泳的样品，因此，进行第二向电泳前，要将第一向电泳后的凝胶条包埋在第二向电泳的凝胶板中。因为两向电泳的分离系统不同，需将第一向电泳后的凝胶预先在第一向电泳分离系统中振荡平衡，再包埋于第二向电泳凝胶板的电泳起始端，然后按照SDS-PAGE的方法进行电泳。
平衡液的体积随胶条的长度而异。平衡的过程分为两步：第一步平衡液的成分主要是Tris缓冲液、SDS、DTT、尿素和甘油。平衡的主要作用是使第一向胶条上的蛋白质变性。平衡液中的尿素和甘油可以增加溶液的黏度，减少电内渗。电内渗作用是由固相化的两性电解质造成的，它影响蛋白质从第一向到第二向转移。SDS用于变性蛋白质，是蛋白质带上负电荷，这对第二向SDS-PAGE来讲是十分重要的。DTT是为了在蛋白质与SDS充分结合的同时，二硫键也得到还原；第二步的平衡液是用IAA（碘乙酰胺）代替DTT，这一步是用来烷基化自由DTT和蛋白质所带的自由巯基，否则，自由DTT在二向迁移过程中会产生假条纹现象，在银染后会观察出来。两次平衡的时间均为15分钟。如果图谱的竖直条纹太多则平衡时间可适当延长到20分钟，时间太短时蛋白质没有被SDS充分包裹，容易产生水平条纹。
2． [操作步骤]
1.使用前每10ml平衡缓冲液中加入100mgDTT ，取出IPG胶条分别放入平衡管中（支持膜贴着管壁，每个管中放入一根IPG胶条），在振荡仪上平衡15min后倒掉平衡缓冲液。
2.每10ml平衡缓冲液中加入250mgIAA （碘乙酰胺），将胶条放入管中在振荡仪上平衡15min后倒掉缓冲液。
3．[试剂准备]
1.平衡缓冲液 (0.05 M Tris-HCl , pH 8.8，6 M 尿素, 30% (w/v) 甘油和2% (w/v)
SDS)：180 g尿素, 150 g甘油, 10 g SDS和16.7 ml分离胶缓冲液溶于去离子水中，最终将
体积补足到500ml。此种缓冲液可于 室温下保存两周。
2. 溴酚蓝溶液: 0.25% (w/v) 溴酚蓝溶于分离胶缓冲液中 25 mg溴酚蓝溶于10 ml 分离胶缓冲液中， 4°C储存。
3.DTT
4.IAA
