蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南(十三)
图17. TFA浓度对峰形和选择性的影响
洗脱液:加入如图所示的TFA,以20%~32%的乙腈(ACN)梯度洗脱,洗脱时间为15分钟。
样品1.血管紧张素II 2.血管紧张素III3.血管紧张素I
其它离子对试剂。尽管目前为止TFA仍是最常用的离子对试剂,但蛋白质/多肽分离有时会采用磷酸和七氟丁酸(HFBA)等其它试剂。
如图18所示,一些情况下,磷酸可分离一些TFA无法分离的多肽。通常磷酸盐使用浓度约为20-30 mM,pH为2~2.5。此外,磷酸盐缓冲液对一些蛋白质的分离效果要优于TFA。
尽管同TFA一样,磷酸盐缓冲液使用的pH通常较低,但磷酸盐缓冲液也能适应较高的pH,为选择性和分辨率的改变提供了机会(见17页)。
将磷酸盐作为离子对试剂的主要弊端是:磷酸盐不挥发,很难从肽中去除。
一些时候,七氟丁酸用作组蛋白等碱性蛋白分离的离子对试剂
图18. 使用除TFA以外的离子对试剂可能会产生不同的选择性
条件
色谱柱:C18 宽孔柱, 4.6 x 250 毫米
洗脱液:
A.4%~40% 乙腈—0.1%TFA体系,pH=2,18分钟梯度洗脱。
B.4%~40% 乙腈—20mM 磷酸体系,pH=2,18分钟梯度洗脱。
样品:
缓激肽
神经降压素
蛙皮素
章鱼唾腺精
pH值对多肽保留行为的影响。不论采用TFA和磷酸,还是其它离子对试剂,用于多肽分离的反相流动相通常适应的pH值较低。
在低pH值条件下,羧酸基团——端羧基,以及天冬氨酸和谷氨酸的侧链会进行质子化,且仅有轻微极性。
将流动相的pH值增加至6~7将会使羧酸基团离子化,减弱多肽的疏水性。这将降低各种多肽的保留值,但尤其影响含天冬氨酸或谷氨酸的多肽(图19)。
与其它多肽相比,含天冬氨酸和谷氨酸的多肽的保留值降低更多,从而改变了选择性。尽管增加多肽分离流动相pH的做法不经常采用,但它可以在一些特定情况下发挥作用。
图19. 流动相的pH值会影响多肽的保留值,尤其是含酸性氨基酸残基(天冬氨酸和谷氨酸)的多肽。
条件
色谱柱:ACE 5 C18-300,4.6 x 250 mm
洗脱液:
A.20%~32% 乙腈—0.1%TFA体系,pH=2,15分钟梯度洗脱。
B.20%~32% 乙腈—10mM NH4OAc体系,pH=7,15分钟梯度洗脱。
样品
血管紧张素II
血管紧张素III
血管紧张素I
流速。流动相的流速对反相高效液相色谱法分离的分辨率影响不大。
如图20所示,流动相流速为0.5、1.0或2.0 ml/min时,胰蛋白酶图谱中多肽的分辨率大致相同。
但梯度体积必须恒定才能维持分辨率一致。
这需要随着流速的增加减少梯度洗脱时间。
体系压力随着流速的增加而增加;体系压力可能会限制可用的流速。
此外,较高的流速还会使检测灵敏度稍有降低,但可能增加大分子蛋白或疏水性蛋白的溶解度。
图20. 流动相的流速对多肽的分辨率影响不大。随着流速的变化,总梯度体积必须保持恒定才能维持分辨率一致。
条件
色谱柱:C18小孔柱,4.6 x 250 mm
洗脱液:10%~50% 乙腈~0.1% TFA 体系,时间、流速如图所示
样品β-乳球蛋白的胰蛋白酶水解物