蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南（十五）
其它离子对试剂。尽管目前为止TFA仍是最常用的离子对试剂，但蛋白质/多肽分离有时会采用磷酸和七氟丁酸（HFBA）等其它试剂。
如图18所示，一些情况下，磷酸可分离一些TFA无法分离的多肽。通常磷酸盐使用浓度约为20-30 mM，pH为2~2.5。此外，磷酸盐缓冲液对一些蛋白质的分离效果要优于TFA。
尽管同TFA一样，磷酸盐缓冲液使用的pH通常较低，但磷酸盐缓冲液也能适应较高的pH，为选择性和分辨率的改变提供了机会（见17页）。
将磷酸盐作为离子对试剂的主要弊端是：磷酸盐不挥发，很难从肽中去除。
一些时候，七氟丁酸用作组蛋白等碱性蛋白分离的离子对试剂
图18. 使用除TFA以外的离子对试剂可能会产生不同的选择性
条件
色谱柱：C18 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米
洗脱液：
A.4%~40% 乙腈—0.1%TFA体系，pH=2,18分钟梯度洗脱。
B.4%~40% 乙腈—20mM 磷酸体系，pH=2,18分钟梯度洗脱。
样品:
缓激肽
神经降压素
蛙皮素
章鱼唾腺精
pH值对多肽保留行为的影响。不论采用TFA和磷酸，还是其它离子对试剂，用于多肽分离的反相流动相通常适应的pH值较低。
在低pH值条件下，羧酸基团——端羧基，以及天冬氨酸和谷氨酸的侧链会进行质子化，且仅有轻微极性。
将流动相的pH值增加至6~7将会使羧酸基团离子化，减弱多肽的疏水性。这将降低各种多肽的保留值，但尤其影响含天冬氨酸或谷氨酸的多肽（图19）。
与其它多肽相比，含天冬氨酸和谷氨酸的多肽的保留值降低更多，从而改变了选择性。尽管增加多肽分离流动相pH的做法不经常采用，但它可以在一些特定情况下发挥作用。
图19. 流动相的pH值会影响多肽的保留值，尤其是含酸性氨基酸残基（天冬氨酸和谷氨酸）的多肽。
条件
色谱柱：ACE 5 C18-300，4.6 x 250 mm
洗脱液：
A.20%~32% 乙腈—0.1%TFA体系，pH=2,15分钟梯度洗脱。
B.20%~32% 乙腈—10mM NH4OAc体系，pH=7,15分钟梯度洗脱。
样品
血管紧张素II
血管紧张素III
血管紧张素I
流速。流动相的流速对反相高效液相色谱法分离的分辨率影响不大。
如图20所示，流动相流速为0.5、1.0或2.0 ml/min时，胰蛋白酶图谱中多肽的分辨率大致相同。
但梯度体积必须恒定才能维持分辨率一致。
这需要随着流速的增加减少梯度洗脱时间。
体系压力随着流速的增加而增加；体系压力可能会限制可用的流速。
此外，较高的流速还会使检测灵敏度稍有降低，但可能增加大分子蛋白或疏水性蛋白的溶解度。
图20. 流动相的流速对多肽的分辨率影响不大。随着流速的变化，总梯度体积必须保持恒定才能维持分辨率一致。
条件
色谱柱：C18小孔柱，4.6 x 250 mm
洗脱液：10%~50% 乙腈~0.1% TFA 体系，时间、流速如图所示
样品β-乳球蛋白的胰蛋白酶水解物
