蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南（十六）
选择合适的色谱柱
微粒。通过与柱内填充微粒疏水表面的相互作用实现蛋白质与多肽的分离。
柱内填充粒通常以硅胶为基础，这是因为硅胶的稳定性高，能够在大多数溶剂条件下（除了pH大于6.5的情况）保持稳定，此外，硅胶可以形成各种大小的具有不同直径的多孔球形颗粒。
硅胶纯度。高效液相色谱柱所用硅胶填料的纯度对分离性能至关重要。金属离子杂质会导致峰拖尾和分辨率下降，如图7A所示（0.01%和0.005%的TFA）。
含金属离子杂质（图7A）的硅胶需要采用高浓度离子对试剂（如三氟乙酸（TFA））维持良好的峰形。
图7. 硅胶纯度会影响多肽的峰形，尤其是加入的离子对试剂浓度较低时。高纯度硅胶所需离子对试剂的浓度远比低纯度硅胶低。
洗脱液：加入如图所示的TFA，以10%-55%的乙腈（ACN）梯度洗脱，洗脱时间为37.5分钟。
低浓度TFA会导致峰形较差且分辨率下降。硅胶纯度较高时（图7B），0.005%的低浓度TFA会产生良好的峰形。这在液相色谱-质谱联用法中尤其重要，因为在使用电喷雾接口时TFA会导致信号减弱。液相色谱-质谱联用法中低浓度的TFA会获得更好的检测信号。
孔径。通常，反相高效液相色谱法中小孔（~100埃）硅胶分离蛋白质的效果较差。大孔硅胶（~300埃直径）可以更好地分离蛋白质（参考文献4）。
如图8所示，蛋白质无法进入小孔，只与极小的外表面相互作用实现分离。
大孔硅胶允许蛋白质，甚至更大的多肽进入小孔，从而与疏水界面充分作用，因此最终的峰形更好，分辨率更高。如今，大孔硅胶已普遍应用于蛋白质的分离中。
由蛋白酶水解等产生的小分子肽能够进入小孔硅胶的孔隙内，从而与疏水界面相互作用，因此小孔硅胶也可用于蛋白质水解物的分离。
但是大孔硅胶也能较好地分离多肽，且具有不同的选择性和分辨率。
图8. 反相高效液相色谱（左侧）常用的小孔（~100埃）粒子只允许少量蛋白质进入孔内，因此限制了表面相互作用。大孔粒子（~300埃，右侧）允许蛋白质进入孔内与疏水界面相互作用。
疏水界面。用碳氢化合物分子对硅胶进行改性，从而形成疏水界面。
含烃链的氯硅烷，如十八烷基氯硅烷，与硅胶（表面有极性硅烷醇基）反应使碳氢化合物附着在硅胶表面（图9）。
由于位阻效应，有机硅烷分子仅与硅胶表面部分硅烷醇基反应，因此大量的极性硅烷醇基仍然会留在硅胶表面。
在“封端”过程中，较小的有机硅烷依次与极性硅烷醇基反应，从而减少硅胶表面极性硅烷醇基的数量。
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