高通量测序技术的原理及各平台优势和实践应用的分析 4
表一：NGS平台概述。
单分子长读长测序（PacBio和ONT）
最近这段时间，最常用的长读长测序法平台就是使用PacBio Biosciences（PacBio）57的单分子实时测序法（single-molecule real-time sequencing, SMRT）（图5a）。该设备使用了一个特制的流动单元，其中包含了成千上万的单独的底部透明的皮升孔（picolitre wells）——zero-mode waveguides（ZMW）58。短读长SBS技术需要使得聚合酶结合DNA，沿着DNA进行扩增，而PacBio则固定聚合酶在空的底部，让DNA链通过ZMW。由于有聚合酶有固定的位置，因此该系统可以对单分子DNA进行测序。dNTP结合在每个孔的单分子模板上，通过激光或者成像设备记录ZMW底部标记在核糖核酸上的发射波长的颜色与持续时间来进行序列的读取。聚合酶在结合dNTPs的过程中，切割dNTP结合的荧光基团，使得荧光基团在第二个标记的碱基进入ZMW前将前一个荧光基团去除。SMRT平台也使用了独特的环状模板，这种方式的模板可以使得聚合酶反复读取模板的序列。尽管这种方法不太容易对长度大于3kb的片段反复读取，但是短的模板却可以反复读取多次57,59。由于多次读取同一序列，因此系统会产生多次测序后的保守序列（consensus sequence, CCS）。
2014年，第一个消费级别的nanopore测序仪的原型机——MinION在Oxford Nanopore Technologies（ONT）诞生。与其他平台不同的是，nanopore测序仪并不监测模板DNA结合或杂交的核糖核酸。其它平台通过监测次级信号，光，颜色或pH等来进行碱基序列的读取，二nanopore则直接对天然的ssDNA分子进行读取。为达成此，DNA需要通过一个蛋白孔（protein pore）（图5b），孔也会因为DNA分子的通过导致的电压阻塞（voltage blockade）的发生。对这些电荷瞬时的追踪称为squiggle space，特定DNA序列通过孔会产生特定的电压改变，这被称为k-mer。相比于1-4种可能的信号，nanopore拥有1000多种可能的k-mer，尤其是当天然DNA序列中存在修饰的碱基的时候。最近的MK1 MinION流动单元由特殊应用的芯片组成，包涵了512个独立的通道，每秒可以读取70bp长度，到2016年预计能够增加到500bp/秒。新推出的PromethION设备是包含了48个独立流动单元的高通量平台。该项工作最多可以在2天内输出～2-4Tb的数据量，这使可能其成为HiSeq X系列的强力竞争者。与PacBio的环状模板类似的是，ONT MinION使用一个leader-harpin library结构。这使得正向DNA链可以通过孔，接着harpin蛋白结合双链，最后是反义链。这产生了1D和2D reads，1D链可以通过比对产生一个保守的2D read。
