饲料粗蛋白测定的测定方法
实验概要
Method for the determination of crude protein in feedstuffs
本标准参照采用ISO5983-1979《动物饲料-氮含量的测定和粗蛋白含量计算》。
1 主题内容与适用范围
本标准规定了饲料中粗蛋白含量的测定方法。
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。
实验原理
凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收液吸收后，再用酸滴定。测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白的含量。
主要试剂
4 试剂
4.1硫酸（GB625）:化学纯，含量为98%，无氮。
4.2混合催化剂
0.4g 硫酸铜，5个结晶水（GB665）， 6g 硫酸钾（HG3-920）或硫酸钠（HG3-908），均为化学纯，磨碎混匀。
4.3 氢氧化钠（GB629）：化学纯，40%水溶液（M/V）。
4.4硼酸（GB628），化学纯，2%水溶液（M/V）。
4.5混合指示剂溶液
甲基红（HG3-958）0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿（HG3-1220）0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。
4.6盐酸标准溶液，c(HCl)=0.1mol/L、0.02mol/L
配制如下：
移取8.3mL 盐酸(分析纯)，于1000mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。此溶液为c(HCl)=0.1mol/L。
移取1.67mL 盐酸(分析纯)，于1000mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。此溶液为c(HCl)=0.02mol/L。
4.7蔗糖，分析纯。
4.8硫酸铵，分析纯，干燥。
4.9硼酸吸收液
1%硼酸水溶液1000mL，加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL， 0.1% 甲基红乙醇溶液7mL， 4%氢氧化钠水溶液0.5mL，混合，置阴凉处保存期为一个月(全自动程序用)。
主要设备
5仪器设备
5.1实验室用样品粉碎机或研钵；
5.2分样筛，孔径0.45mm(40 目) ；
5.3 分析天平，感量0.0001g；
5.4消煮炉或电炉；
5.5 滴定管，酸式，10、25mL ；
5.6凯氏烧瓶，250mL ；
5.7 凯氏蒸馏装置，常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式；
5.8锥形瓶，150、250mL ；
5.9 容量瓶，100mL ；
5.10 消煮管，250mL ；
5.11定氮仪，以凯氏原理制造的各类型半自动，全自动蛋白质测定仪。
实验材料
6 试样的选取和制备
选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g，粉碎后全部通过0.45mm（40 目筛），装于密封容器中， 防止试样成分的变化。
实验步骤
7 分析步骤
7.1 仲裁法
7.1.1试样的消煮
称取试料0.5～1g(含氮量5～80mg)准确至0.0002g，放入凯氏烧瓶（5.6）中，加入6.4g混合催化剂（4.2），与试样混合均匀，再加入12mL 硫酸（4.1）和2 粒玻璃珠，将凯氏烧瓶（5.6）置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力(360～410℃)直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，至少2h。
7.1.2氨的蒸馏
7.1.2.1 常量蒸馏法
将试料消煮液（7.1.1）冷却，加入60～100mL 蒸馏水，摇匀，冷却。将蒸馏装置（5.7）的冷凝管末端浸入装有25mL 硼酸吸收液和2 滴混合指示剂（4.5）的锥形瓶内。然后小心地向凯氏烧瓶中加入50mL 氢氧化钠溶液（4.3），轻轻摇动凯氏烧瓶（5.6），使液溶混匀后再加热蒸馏，直至流出液体积为100mL。降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏1～2min，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内， 然后停止蒸馏。
7.1.2.2 半微量蒸馏法
将试样消煮液（7.1.1）冷却，加入20mL 蒸馏水，转入100mL 容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，做为试样分解液。将半微量蒸馏装置（5.7）的冷凝管末端浸入装有20mL 硼酸吸收液和2 滴混合指示剂（4.5）的锥形瓶内。蒸汽发生器（5.7）的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色， 否则需补加硫酸。准确移取试样分解液10～20mL注入蒸馏装置（5.7）的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL 氢氧化钠溶液（4.3），小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏4min，降下锥形瓶（5.8），使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。
注：7.1.2.1 和7.1.2.2 蒸馏法测定结果相近，可任选一种。
7.1.2.3 蒸馏步骤的检验
准确称取0.2g硫酸铵（4.8），代替试料，按7.1.2或7.2.2 步骤进行操作，测得硫酸铵的质量分数为21.19± 0.2%，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。
7.1.3滴定
用7.1.2.1 或7.1.2.2 法蒸馏后的吸收液立即用0.1mol/L （4.6.1）或0.02mol/L（4.6.2）盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。
7.2 推荐法
7.2.1试样的消煮
称取0.5～1g 试料(含氮量5～80mg)准确至0.0002g，放入消化管中，加2 片消化片(仪器自备)或6.4g混合催化剂，12mL 硫酸（4.1），于420℃下在消煮炉上消化1h。取出放凉后加入30mL 蒸馏水。
7.2.2氨的蒸馏
采用全自动定氮仪（5.11）时，按仪器本身常量程序进行测定。
采用半自动定氮仪（5.11）时，将带消化液的管子插在蒸馏装置上，以25mL 硼酸溶液为吸收液，加入2 滴混合指示剂（4.5），蒸馏装置的（5.7）的冷凝管末端要浸入装有吸收液的锥形瓶内，然后向消煮管中加入50mL 氢氧化钠溶液进行蒸馏。蒸馏时间以吸收液体积达到100mL 时为宜。降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内。
7.2.3滴定
用0.1mol/L标准盐酸溶液（4.6.1）滴定吸收液，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。
8 空白测定
称取0.5g蔗糖，代替试样，按第七章进行空白测定，消耗0.1mol/L盐酸标准溶液（4.6.1）的体积不得超过0.2mL。消耗0.02mol/L盐酸标准溶液（4.6.2）体积不得超过0.3mL。
9.1计算见下式：
粗蛋白质（％）=（V2-V1）·c×0.0140×6.25/（m×V＇/V） ×100
式中：V2——滴定试样所需标准溶液体积，mL；
V1——滴定空白时所需标准酸溶液体积，mL；
C——盐酸标准溶液浓度，mol/L；
m——试样质量，g；
V——试样分解液总体积，mL；
V′——试样分解液蒸馏用体积，mL；
0.0140 ——每毫克当量氮的克数；
6.25——氮换算成蛋白质的平均系数。
9.2 重复性
每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。
当粗蛋白质含量在25％以上时，允许相对偏差为1％。
当粗蛋白质含量在10％～25％之间时，允许相对偏差为2％。
当粗蛋白质含量在10％以下时，允许相对偏差为3％。
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