如何做好荧光定量PCR实验？（四）
3.7 模板浓度
起始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数PCR扩增和荧光PCR扩增，104到106个起始目的分子就足以观测到好的荧光曲线（或在溴化乙锭染色胶上观察到）。所需的最佳模板量取决于基因组的大小（下表）。举例说，100ng到1μg的人类基因组DNA，相当于3×104到3×105个分子，足以检测到单拷贝基因的PCR产物。质粒DNA比较小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg级的。对于一般的检测样品，10－100ng的量就足够检测了。当然对模板做一个梯度稀释，对于定量PCR而言是非常容易，且能分析扩增效率。
表1. 基因组大小和分子数目的比例
基因组 DNA | Size(bp)* | Target Molecules/µg of Genomic DNA | Amount of DNA(µg) for -10^5 Molecules |
E. coli | 4.7×10^6 | 1.8×10^8 | 0.001 |
Saccharomyces cerevisiae | 2.0×10^7 | 4.5×10^7 | 0.01 |
Arabidopsis thaliana | 7.0×10^7 | 1.3×10^7 | 0.01 |
Drosophila melanogaster | 1.6×10^8 | 6.6×10^5 | 0.5 |
Homo sapiens | 2.8×10^9 | 3.2×10^5 | 1.0 |
Xenopus laevis | 2.9×10^9 | 3.1×10^5 | 1.0 |
1.0Mus musculus | 3.3×10^9 | 2.7×10^5 | 1.0 |
Zea mays | 1.5×10^10 | 6.0×10^4 | 2.0 |
pUC 18 plasmid DNA | 2.69×10^3 | 3.4×10^11 | 1×10^(-6) |
3.8 防止残余（Carry-over）污染
PCR易受污染的影响，因为它是一种敏感的扩增技术。小量的外源DNA污染可以与目的模板一块被扩增。当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发生共同来源的污染。这称之为残余污染。从其他样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源（非残余污染）。
可以在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染。使用带滤芯的移液管可以阻止气雾剂进入eppendorf管内。为PCR样品配制和扩增后分析设计隔离的区域，在准备新反应前更换手套。总是使用不含有模板的阴性对照检测污染。
使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。
一种防止残余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。这种酶（也称为尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶。在扩增过程中将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧啶使得可以把前面的扩增产物同模板DNA区分开来。因为前面的扩增产物对UDG敏感，所有可以在PCR前对新配制的反应用UDG处理以破坏残余产物。
4、高产量，特异和灵活的定量PCR试剂体系
影响PCR的因素如此之多，您有时很难区分是什么导致您的实验结果不佳。降低实验的不稳定因素是使用优质可靠的产品。
使用优质、性能可靠的热启动酶、优质的dNTP、Mg离子、UNG/dUTP防污染系统预混成的定量PCR试剂体系，最大程度的降低了反应变量，提高了实验的可重复性和可靠性。您还需要进行以下步骤的准备：设计引物和探针、合成引物和探针、正确储藏、得到高质量的模板，随后，您仅需要进行退火温度的优化，就能得到好的实验结果。
FQ PCR MASTER Mix-UDG（hot start）同竞争对手的定量PCR体系相比提供了更优异的结果。使用这种产品，您可以在您的PCR中得到更好特异性和更高的灵敏度，同时可以灵活地选择您所喜欢的扩增条件，检测方法和设备。
实时定量PCR是快速增长的PCR方法，它可以精确、可重复地定量起始物质。FQ PCR MASTER Mix-UDG（hot start）是一种方便使用的反应混合液，为定量分析进行了优化。它包含了荧光PCR所必须的成分（如缓冲液，dNTP，聚合酶）。只需加入您的模板，扩增引物和荧光标记探针。您就可以得到实时qPCR所需的特异性和灵活性。
高产量和特异性的扩增
FQ PCR MASTER Mix-UDG（hot start）提供了强大的PCR扩增，可以使用多个模板组。所使用的Taq DNA聚合酶具有热启动特性。这极大地降低和消除了错误配对和非特异性扩增，使您得到较高产量，并增加特异性。整合的UDG（尿苷酸DNA糖基化酶）防止残余污染的能力防止了非模板DNA的扩增，从而降低了假阳性，使结果更可靠。
在产量和灵敏度方面，Quantitative PCR MASTER Mix-UDG（hot start）的灵敏度极高（阈循环）。您可以更精确地定量低拷贝的基因，并在较宽的目的浓度范围内检测线性剂量反应。
高度灵活性
除了灵敏度和特异性外，Universal PCR Master Mix Kit在分析设置，检测方法和设备上给您提供了较高的自由度。使用Universal PCR Master Mix Kit，您可以：
对扩增的不同模板优化镁离子浓度，由于提供了附加的氯化镁，所以您可以方便地配置Mix体系。
可以更灵活的进行普通PCR和荧光PCR。
可以在多种设备上使用，如ABI Prism® 7700, ABI GeneAmp® 5700和Bio-Rad的I-Cycler。
可以利用多种检测方法的优点，包括TaqMan®探针和Molecular Beacon，您不必局限于特定的试剂盒。
