DNA重组（DNA recombination）技术：DNA重组与鉴定-1
重组DNA是在体外用限制性内切酶，将不同来源的DNA分子进行特异地切割，获得的目的基因或DNA片段与载体重新连接，从而组成一个新的DNA杂合分子。重组的DNA分子能够通过一定的方式进入相应的宿主细胞，在宿主细胞中进行无性增殖，获得大量的目的基因或DNA片段，此过程称基因克隆。重组的DNA分子也能够在宿主细胞中进行表达，获得相应的蛋白质的表达。
一、DNA重组
重组DNA分子的构建所需的目的基因或DNA片段可来自基因组DNA、cDNA以及人工合成的DNA片段；载体最常用的是质粒、噬菌体及逆转录病毒等；它们在限制性内切酶的作用下，可形成粘性末端或平齐末端，在DNA连接酶的作用下可连接成一个DNA重组体。
（一）目的DNA片段与载体的连接
主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体遗传性状的目的。DNA克隆的一项关键技术就是DNA重组技术，所谓DNA重组，就是指把外源目的基因“装进”载体过程，即DNA的重新组合。这种重新组合的DNA叫做重组体，因为是由两种不同来源的DNA组合而成，所以又称异源嵌合DNA。
载体在DNA克隆中是不可缺少的，目的基因片段与之共价连接形成重组体后，才能进入合适的宿主细胞内进行复制和扩增。作为载体DNA分子，必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达能力，这样，外源目的基因装入该载体后，才能在载体的带动下一起复制，达到无性繁殖的目的；载体分子不宜过大，以便于DNA体外操作，同时载体DNA与宿主核酸应容易分开，便于提纯；载体上应具有两个以上的容易检测的遗传标记，以区分阳性重组分子和阴性重组分子。选择性标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷型及形成嗜菌斑的能力等；载体应该具有多个限制性内切酶的单一切点，以便从中选出一种酶，使它在目的基因上没有切点，保持目的基因的完整性。载体上的酶切位点最好是位于检测表型的遗传标记基因之内，这样目的基因是否连进载体就可以通过这一表型的改变与否而得知，便于筛选重组体。
DNA重组本质上是一个酶促生物化学过程，
DNA连接酶是其中的重要角色。DNA连接酶主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为三步：首先ATP与T4噬菌体DNA连接酶通过ATP的磷酸与连接酶中赖氨酸的氨基形成磷酸-氨基键而连接产生酶-ATP复合物；然后酶-ATP复合物活化DNA链5’端的磷酸基团，形成磷酸-磷酸键；最后DNA链3’端的羟基活化并取代ATP，与5’端磷酸基团形成磷酸二酯键，并释放出AMP，完成DNA之间的连接。大肠杆菌
DNA连接酶催化DNA分子连接的机理与T4噬菌体DNA连接酶基本相同，只是辅助因子是NAD +而不是ATP。
具有相同粘性末端的DNA分子比较容易连接在一起，因为相同的粘性末端容易通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构，连接酶利用这个相对稳定的结构，行使间断修复的功能，就可以使两个DNA分子连接在一起。
大肠杆菌
DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，但T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即使两端平端的双链DNA分子连接起来的功能。对于这种连接反应的机理目前还不清楚，总的来说这种连接的效果比粘性末端的连接效果要低的多，可能是因为末端DNA分子无法形成类似粘性末端分子那样的相对稳定的结构。可通过增加DNA的浓度或提高T4噬菌体DNA连接酶浓度来提高平末端的连接效率。
连接反应的一项重要参数是温度。理论上说，连接反应的最佳温度是37℃，此时连接酶的活性最高。但37℃时粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此，人们找到了一个最适温度，即12～16℃。此时既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构的稳定。
进行DNA重组的方法有很多，主要有粘端连接法、平端连接法，后者包括平接法和接头法以及粘-平端连接法。这些方法的采用主要依据外源DNA片段末端的性质，以及质粒载体与外源DNA上限制酶酶切位点的性质来做选择。
1.粘性末端连接法：
若目的基因或DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末端，这将是最方便的克隆途径。同源粘性末端包括相同一种内切酶产生的粘性末端和不同的内切酶产生的互补粘性末端。粘性末端连接（cohesive
end ligation）得到的重组质粒能够保留结合处的限制酶切位点，因此，可以使用原切割内切酶，重新将插入片段从重组体上完整地切割下来。
在粘性末端连接时，除重组体外，还有一定数量的载体自身环化分子，这将产生较高的假阳性克隆背静。针对这一问题，往往需要在连接前，用牛小肠碱性磷酸酶去除载体的5’磷酸以抑制质粒DNA的自身环化。另外，如果用一种限制性内切酶切割载体和外源DNA，连接时插入片段可以两个方向插入载体中。粘性末端连接时还有一个问题是片段的多拷贝插入。欲筛选出含有正确插入方向和单拷贝插入片段的重组体，需要将重组体进行内切酶图谱分析。适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般采用插入片段摩尔数：载体摩尔数为3：1。
2.同聚体加尾部连接法
同聚体加尾部连接法（homopolymeric tails
ligation）即当目的基因或DNA片段与载体，用限制性内切酶酶切获得的是平齐末端；或者外源DNA片段和载体是两个不相配的DNA片段；此时可用末端转移酶使其中的一个DNA分子3’端上接上多聚A,另一个DNA片段3’端上接上多聚T。这样两个DNA分子的尾部可按A-T配对原则相联，并由DNA聚合酶填补空隙，最后由DNA连接酶封口成重组DNA分子。
3.人工合成接头连接法
人工合成接头连接法（artifical linker ligation）即目的基因或DNA片段的两端接上能够被某一限制性内切酶识别的DNA序列（接头），再在该酶的酶解作用下，和载体获得相同的粘性末端，并进行连接。见图7-9。
(二)重组DNA分子转入宿主细胞
体外重组生成的重组子必须导入合适的宿主细胞中才能进行复制、扩增和表达。宿主细胞以大肠杆菌为代表的原核细胞和包括哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核细胞。对不同的宿主细胞应采取不同的方法导入DNA，但都以获得尽可能多的转化宿主细菌或细胞为前提。
1.重组DNA分子导入原核细胞
将重组的DNA分子引入细菌(原核细胞),使其在细菌体内扩增及表达的过程称为转化作用(transformation)。最常用的细菌是大肠杆菌，要选择合适的菌株。细菌在生长过程中，只有某一阶段的细菌才能成为转化的接受体，这一生理状态称为感受态（competent）。
