DNA重组技术(Recombinant DNA)实验原理、用品和步骤（二）
【实验步骤】
1．PCR产物纯化
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段。
2．目的DNA片段连接至T/A克隆载体 即重组DNA分子的构建
反应体系及条件如下：
3．转化
3.1 将感受态细胞置冰中融解。
3.2 将60μl感受态细胞移至无菌试管内。
3.3 加入用于转化的DNA 10μl（＜10ng），轻弹管底混匀。
3.4 冰中放置30分钟。
3.5 42℃放置45~60秒，不要振荡。
3.6 冰中放置2~3分钟。
3.7 加入37℃ 预温好的LB培养基940μl（无抗生素）。
3.8 37℃振荡培养1小时（160~225 rpm）。
4．筛选及增菌
4.1 取适量涂布琼脂平板。
4.2 37℃培养过夜。
4.3 挑取菌落，放在2~5ml LB液体培养基中（含50μg/ml Amp）过夜培养（240 rpm）。
4.4 收集细菌，提取质粒。
5．质粒DNA提取
5.1 2ml 菌液以12000rpm离心1分钟。
5.2 弃上清，沉淀物溶于100μl溶液Ⅰ（1×）中，剧烈振荡，室温5分钟。
5.3 加新配制的溶液Ⅱ200μl，充分混合后冰浴5分钟。
5.4 加溶液Ⅲ 150μl，混匀冰浴5分钟。
5.5 12000rpm离心10分钟,将上清转移到另一离心管中。
5.6 加900μl（2倍体积）的乙醇，震荡混合,室温放置2分钟，沉淀双链DNA。
5.7 12000rpm离心5分钟。
5.8 小心吸去上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,以使所有液体流出.再将附于管壁的液滴除尽。
5.9 用1ml 70%乙醇洗涤沉淀的双链DNA,按“步骤5.8”所述方法去掉上清,在空气中使沉淀的DNA干燥10分钟。
5.10 用50μl含胰RNA酶(20μg/ml)的TE重新溶解核酸,振荡,贮存于-20℃。
6．质粒DNA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定
6.1 质粒DNA的限制性内切酶酶切
将清洁、干燥、灭菌的Eppendorff管（0.5ml）编号，用微量加样器按表1所示将各种试剂分别加入每个管内。
加样后，小心混匀，置于37℃水浴消化过夜，然后65℃ 20分钟终止酶解反应。各酶切样品于-20℃贮存备用。
6.2 琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定质粒DNA酶切片段
6.2.1胶板的准备
取有机玻璃内槽，洗净晾干。取透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（注意，将透明胶带紧贴于有机玻璃内槽的两端边上，不要留空隙）。将有机玻璃内槽置于一水平位置，在距离底板0.5~1.0ml的位置放入梳子。
6.2.2 琼脂糖凝胶的制备
称取0.6克琼脂糖，置于锥形瓶内，加入50ml 1×TAE，瓶口用保鲜膜封盖，在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解，得到1.2
%琼脂糖凝胶液，待其冷却至65℃左右，加入2.5μl溴化乙啶贮存液（10mg/ml），使溴化乙啶终浓度为0.5μg/ml。小心混匀并倒在有机玻璃内槽中，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，避免产生气泡，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1小时左右，待胶凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面1mm深的足够电泳缓冲液，预电泳10分钟。
6.2.3加样
取适量的酶切样品，加入6×载样缓冲液适量（终浓度为1×），用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内。
6.2.4电泳
加完样品后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA带负电荷，由负极向正极移动。电场强度不高于5V/cm。当溴酚蓝染料移动到距离胶板下沿1~2cm处，停止电泳。
6.2.5 观察和拍照
取出凝胶，在波长为254 nm的紫外灯下观察凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或采用有机玻璃防护罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。
以上步骤也可以用凝胶自动成像仪处理。
【实验结果分析】
1．记录DNA重组的方法。
2．观察分析经酶切质粒DNA（实验组）和未经酶切质粒 DNA（对照组）琼脂糖凝胶电泳结果。
