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植物组织制备基因组DNA实验——氯化铯法

2019.3.26

利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。

实验方法原理	加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。
实验材料	植物组织
试剂、试剂盒	抽提缓冲液十二烷基肌氨酸钠 TE 异丙醇溴化乙锭氯化铯
仪器、耗材	离心机
实验步骤	1. 收取10~50 g 新鲜的植物组织。 2. 植物组织用冷的无菌水洗涤、吸干，放人液氮中冻结，用研钵和研杵研成细粉。 3. 将冻结的细粉放入250 ml 的离心瓶中，立即加入抽提缓冲液约每克植物5~10 ml，轻轻搅拌混匀。 4. 加入十二烷基肌氨酸钠使终浓度达1%，于温育1~2 h。 5. 用JA-14转子4℃，5 500 g 离心10min 保留上清，必要时重复此歩骤以除去残渣。 6. 加人0.6体积异丙醇，混合，如果看不见沉淀，于-20℃放置30 min，用JA-14转子4℃，7 500 g 离心15 min，弃上清。 7. 沉淀用9 ml TE缓冲液重悬，加入9.7 g 固体氯化铯，混匀，冰上放置30 min，用JA-14转子，7 500 g 离心10 min，保留上清。 8. 加入0.5 ml 10 mg/ml 的溴化乙锭，冰上放置30 min，4℃ 7500 g 离心10min. 9. 将上清转入两个5 ml 的快封超离心管中，并封口。 10. 用VTi80转子20℃ 525 000 g 离心4 h，或20℃，300 000 g 离心过夜，用15号针头和注射器收集带。 11. 用氯化艳饱和的异丙醇重复抽提DNA以除去溴化乙锭。 12. 加入2体积水和6体积100%乙醇，混匀，-20℃放置1 h，用JA-20或JA-21转子4℃，7500 g 离心10 min。 13. 沉淀用TE缓冲液重悬，加入1/10体积的3 mol/l 乙酸钠和2体积的100%乙酵重悬，重复离心。 14. 沉淀晾干后用TE缓冲液重悬。