将DNA导入酵母细胞实验_电穿孔转化
| 实验材料 | |
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| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | 电穿孔仪：如Bio-Rad公司的带脉冲控制器的Gene Pulser或GIBCO BRL公司的 Cell-Porator 0. 2 cm间隙的一次性电穿孔槽（Bio-Rad)或0.15 cm间隙的微量 电穿孔槽（GIBCO BRL)。 |
| 实验步骤 | 1) 实验前2天，将转化用酵母菌株的单菌落接种于5 mL YPD培养基中，30℃过夜培养至饱和。 2) 转化前1天晚上，在装有500 mL YPD培养基的2 L无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液，于30℃剧烈摇动培养过夜，直到细胞密度达1×lO8细胞/mL (OD6 这一细胞密度表明细胞处于对数生长的中后期。如果对特定的菌株不知道其精确的生长期，可以用不同体积的饱和培养液接种3个不同的烧瓶（基本方案步骤2)。 3) 于4℃以4000 g离心收获培养细胞，细胞用80 mL无菌水重悬。为了增加细胞对电 击的感受性，继续步骤4。如果这种处理并不需要的话，可接步骤6。 乙酸锂处理细胞是可选步骤，用这些步骤制备酵母菌会增加操作时间，如果细胞要冻存以备将来使用，那么就不应进行这一过程。 4) 加入10 mL 10×TE缓冲液，pH 7.5。摇匀，再加入100 mL 1０×乙酸锂储液，旋转 摇匀，于30℃轻轻摇动45 min。 5) 加2.5 mL 1 mol/L DTT,并同时旋转摇动，于30℃轻轻摇动15 min。 6) 将酵母菌悬液用水稀释至500 mL。 7) 洗涤和浓缩细胞3次，每次以4000〜6000 g于4℃离心沉淀细胞，依次重悬细胞， 所用的溶液如下： 第一次沉淀：250 mL冰冷的水第二次沉淀：20〜30 mL冰冷的1 mol/L山梨醇 第三次沉淀：0. 5 mL冰冷的l mol/L山梨醇 每次重悬细胞时应剧烈吹打沉淀，使细胞完全分散开。最后重悬酵母菌的体积应在1.0〜1.5 mL 之间，最终的OD600应为约200。 使用 Bio-Rad 公司的 Gene Pusler： 8a)往一个无菌、冰冷的1. 5 mL微量离心管加入40μL浓缩的酵母菌细胞和<100 ng转化DNA (体积<5μL)，混匀。 转化DNA应溶于低离子强度的缓冲液，如TE或无菌超纯水中。不需要长时间温育，这一时间 可灵活掌握；在转化过程中不需要载体DNA,加载体DNA会急剧降低转化效率。使用<10 ng 的质粒DNA转化时可获得最大的转化效率（转化体/μg)，而使用100 ng DNA转化时，则可获得数目最多的转化体。 9a)将酵母与待转化DNA混合物转移到冰冷的0. 2 cm间隙的一次性电穿孔槽中。 1０a)以1.5kV、25μF、200Ω作脉冲转化，电路中应包括BitRad脉冲控制仪，而这十分重要，如果不这样做的话，将会损坏Gene Pulser。 Gene PuIser设定的时间常数为4.2〜4.9 ms。如果这一时间小于4 ms或出现电流弧（即可见火花或冒烟），那么说明酵母菌/DNA混合物的电导太高。 1la)往电穿孔槽加入1 mL冰冷的1 mol/L山梨醇，用无菌的9 in巴斯德吸管轻轻混匀、回收酵母细胞。 12a)将一部分酵母菌悬液直接涂布在山梨醇选择培养基平板上，于30℃培养3〜6天， 直到平板上出现菌落。 使用 BRL 的 Cell Porator ： 8b)往一支无菌、冰冷的1.5 mL微量离心管中，加入20μL浓缩的酵母菌和待转化的 DNA。 DNA 用量<100 ng,体积<5μL。温育时间可灵活变化（见步骤8a)。 9b)将酵母菌/DNA混合物转移到冰冻的0.15 cm间隙的电转槽中。 1０b)以400 V, 10μF，低电阻下进行脉冲转化。 1lb)取10μL电转混合物加到1. 5 mL无菌的微量离心管中，其中含有0. 5 mL冰冷的1mol/L山梨醇。 12b)将酵母菌悬液直接涂布在山梨醇选择培养基平板上，于30℃培养3〜6天，直到平板上出现菌落。 展开 |
